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【背景】近年来,尽管肿瘤治疗已有很大进步,不断研发新的抗肿瘤药物、出现新的治疗方案,但是治疗效果仍不尽如人意。多药耐药（MDR）,是肿瘤化疗失败的主要原因[1]。针对胃癌多药耐药,目前仍缺乏理想的耐药程度判断标准和有效的耐药逆转剂或调节剂,是亟待解决的重要问题。以经典耐药分子p糖蛋白为靶点,虽已有四代逆转剂,通过基础和临床实验证实能够发挥逆转耐药的作用,但由于其毒副作用和不良的药物代谢动力学作用,尚未被应用于临床[2]。因此,探索新的胃癌耐药逆转方法和解决策略,研发新的耐药逆转剂,对胃癌成功治疗有着非常重大的意义。在药物研发方面,小分子短肽有众多优点,具有应用于临床的优势,是目前研究的热点领域[3]。前期研究中,我们课题组利用噬菌体随机十二肽库,通过体外生物淘选耐药细胞和亲本细胞,获得了能特异结合于胃癌耐药细胞的短肽GMBP42。体内药效学研究初步证实,GMBP42能够在裸鼠体内抑制耐药肿瘤生长,部分逆转肿瘤的耐药表型,提高肿瘤对化疗药物的敏感性。进一步鉴定耐药逆转短肽GMBP42的结合受体,深入研究其在耐药中的作用及分子机制,对于全面认识肿瘤耐药机理有重要意义,并为研发新型多药耐药逆转生物制剂奠定实验基础和提供理论支持。本课题将在这方面展开研究。【目的】1.鉴定GMBP42在耐药细胞中的结合,获得其受体的分布信息。2.筛选GMBP42的结合受体,为探讨GMBP42的作用机制奠定基础。3.明确GMBP42的耐药逆转作用,初步分析其作用机制。【方法】1.免疫细胞化学染色方法观察GMBP42在耐药细胞的结合,明确受体的亚细胞定位。流式细胞仪分析GMBP42的受体在耐药细胞的表达量。2.免疫共沉淀纯化和富集GMBP42结合的受体蛋白,质谱分析初步筛选GMBP42结合受体。3. MTT实验观察GMBP42对细胞生长的影响。4.体外药物敏感实验检测GMBP42在细胞中对抗肿瘤药物IC50值的影响。5.阿霉素蓄积和潴留实验观察GMBP42对药物在细胞内蓄积和潴留的影响。6.细胞凋亡分析GMBP42对细胞凋亡的影响。7. RT-PCR方法检测GMBP42对部分耐药相关膜分子表达水平的影响。8. Western-blot方法检测GMBP42作用细胞后MDR1和凋亡相关分子（BCL-2, BAX）的表达情况。【结果】1. GMBP42与细胞的结合情况和结合受体的相关信息。1)免疫细胞化学结果说明GMBP42在耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中呈阳性反应,胞膜和核周胞浆均可见明显的阳性颗粒（棕黄色或者棕褐色）,在亲本SGC7901细胞中呈阴性反应。2)流式细胞分析结果显示GMBP42结合的受体在耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中表达量要明显多于亲本SGC7901细胞。3)免疫共沉淀纯化富集GMBP42结合的蛋白,质谱分析初步筛选GMBP42结合受体。延伸因子1α（EEF1A,Elongation factor 1-alpha）在两个蛋白条带中均检测到,是我们所关注的受体候选分子。2. GMBP42在逆转耐药中的作用和分子机制研究。1) MTT实验结果证实GMBP42不影响耐药细胞的正常生长。2)体外药物敏感实验证实GMBP42可以降低耐药细胞SGC7901/VCR和SGC7901/ADR阿霉素、5-氟尿嘧啶和丝裂霉素的IC50值,提高耐药细胞对这些药物的敏感性,而对顺铂的IC50值没有影响。3)阿霉素蓄积和潴留实验结果显示,GMBP42作用耐药细胞后,阿霉素蓄积和潴留的荧光强度要明显强于对照组,说明GMBP42能增加阿霉素在细胞内蓄积和潴留。4) FCM分析细胞的凋亡,加入GMBP42后的耐药细胞,与对照组相比,凋亡指数增加,说明GMBP42能够促进药物诱导细胞发生凋亡。5) RT-PCR结果显示加入GMBP42的耐药细胞组,耐药相关膜分子MDR1（（P-gp）在RNA水平上表达下降。6） Western-blot结果显示GMBP42作用后的耐药细胞,从蛋白水平上耐药相关膜分子MDR1（P-gp）的表达量下降,凋亡抑制基因BCL-2的表达降低,凋亡促进基因BAX的表达升高。【结论】1. GMBP42与耐药细胞高亲和力结合,受体在耐药细胞的表达量要明显高于亲本细胞。对GMBP42结合受体的初步筛选,共得到了19个候选蛋白分子,其中延伸因子1α（EEF1A,Elongation factor 1-alpha）在两个蛋白条带中都出现,是最有可能的候选受体分子。2. GMBP42对细胞的生长本身无影响,可增加细胞内药物的蓄积和潴留,降低部分化疗药物的IC50值,促进细胞的凋亡。此作用可能通过调节凋亡相关基因BCL-2/BAX、降低耐药相关膜分子MDR1的表达得以实现的,其相关分子机制仍需深入研究。