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大蒜是我国传统的药食两用资源,其功能性风味物质――蒜素类物质是大蒜的药理基础,大蒜蒜氨酸酶(EC 4.4.1.4)在产生该类物质的过程中起到重要的酶促催化作用。大蒜功能性风味物质的提取得率与蒜氨酸酶的活性调控有密切联系,因此首先围绕大蒜蒜氨酸酶的酶学性质展开研究具有十分重要的现实意义。本试验以大蒜鳞茎为原料,依次采用缓冲液粗浸提法、PEG8000沉淀法、ConA-Sepharose亲和层析柱法、羟基磷灰石柱层析法分离纯化出蒜氨酸酶,并采用变性凝胶电泳鉴定其纯度;通过RT-PCR方法扩增出蒜氨酸酶基因,从测得的cDNA序列推测出其氨基酸序列;并进一步研究了大蒜蒜氨酸酶亚基分子量、糖肽键类型等方面的酶学性质及其动力学特性。主要试验结果如下:1、蒜氨酸酶的分离纯化 试验首先通过硫酸铵分级沉淀和PEG8000分级沉淀的选择,确定用20% PEG8000对蒜氨酸酶粗酶液进行直接沉淀,其纯化倍数为5.19倍,回收率90.93%,明显优于30%～45%硫酸铵分级沉淀法;通过ConA-Sepharose亲和层析,得到纯化倍数为20.40倍的蒜氨酸酶酶液,回收率为78.2%;最后经HA柱层析,得到高纯度的蒜氨酸酶,最终纯化倍数为20.68倍,回收率为38.53%。尿-SDS-PAGE电泳图显示,经亲和层析纯化后的酶无杂蛋白带。2、酶Ⅰ、酶Ⅱ的鉴定 在ConA-Sepharose亲和层析操作中,发现大蒜鳞茎中存在两种不同的蒜氨酸酶:命名为酶Ⅰ、酶Ⅱ,其中酶Ⅱ是主要部分,酶Ⅰ活性较弱。酶Ⅱ最后再采用羟基磷灰石吸附层析法纯化,最终纯化倍数为20.68倍,回收率为38.53%。3、大蒜蒜氨酸酶氨基酸序列的测定 从鲜蒜鳞茎中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增出蒜氨酸酶基因,从测得的cDNA序列推测出蒜氨酸酶的氨基酸序列。4、蒜氨酸酶的酶学性质 采用尿-SDS-PAGE法测定酶Ⅰ、酶Ⅱ的亚基分子量分别为44,300、47,500;酶Ⅱ含糖量为5.31%,并推测其糖肽键类型为N-型,紫外可见扫描图证实了辅基磷酸吡哆醛的存在。对蒜氨酸酶的动力学研究表明:在本实验规定的酶活测定条件下,酶反应<WP=10>的最佳pH为6.5,最佳温度为35oC,pH值稳定范围为6～7。酶的稳定性与保存温度有很大的关系,随着温度升高酶活降低的程度越来越大。以合成的S-烯丙基-半胱氨酸亚砜为底物,测定蒜氨酸酶对该底物的米氏常数Km=4.17mmol/L,最大反应速度Vmax=156.25units/mg pr。