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人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)作为疱疹病毒的β-亚族成员,在人群中感染非常普遍。HCMV感染对健康人一般不致病,但对免疫低下人群如新生儿、多次输血、器官移植、艾滋病患者等会致病,甚至导致死亡。pUL49是HCMV病毒编码的蛋白,为病毒复制所必需,缺失pUL49开放阅读框(ORF)的BAC-Towne-ΔUL49病毒转染宿主细胞不能包装出子代病毒粒子,pUL49 mRNA的下调也会严重影响病毒的复制。尽管pUL49非常重要,但其在宿主细胞中的功能及作用机理目前还不明确。本课题为探索pUL49在宿主细胞中的功能,开展了如下研究:构建pUL-49基因过表达的慢病毒载体,包装、扩增、纯化病毒,感染U373细胞,筛选得到pUL49过表达的U373稳定细胞系。我们首先发现在pUL49稳定过表达的U373细胞中细胞增殖能力明显受到抑制,流式细胞检测发现pUL49过表达不诱导细胞凋亡、不影响凋亡相关蛋白的表达,但是使G1/S期细胞数量增加,说明pUL49过表达抑制U373细胞增殖不是通过诱导细胞凋亡,而是通过阻滞细胞周期于G1/S期实现的。为研究pUL49蛋白对U373细胞增殖抑制的分子机制,我们通过基于免疫共沉淀的蛋白质组学筛选得到33种与pUL49相互作用的宿主蛋白,其中一个侯选蛋白是FRK。FRK属于非受体蛋白酪氨酸激酶的一种,结构上与Src家族成员具有高度同源性;FRK具有磷酸化底物,抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,阻滞细胞周期于G1期等作用。为了进一步确定二者之间的相互作用,通过免疫共沉淀技术确定pUL49和FRK在U373细胞中能够相互作用、间接免疫荧光技术确定pUL49和FRK共定位于细胞核。pUL49和FRK相互作用,两者又都抑制细胞增殖,提示pUL49可能通过FRK调控U373宿主细胞的生长增殖。我们设计了针对pUL49和FRK的siRNA,通过过表达和敲低实验组合发现pUL49过表达抑制细胞增殖;敲低FRK促进细胞增殖;在pUL49过表达的细胞中同时敲低pUL49可以部分抵消pUL49过表达引起的增殖抑制;pUL49过表达的同时敲低FRK也能部分抵消pUL49过表达引起的增殖抑制,两者趋势一致;在pUL49过表达的细胞中同时敲低FRK和pUL49,pUL49对增殖的抑制几乎全部被抵消,证实pUL49可通过FRK调控U373宿主细胞的增殖。同样以过表达和敲低实验组合发现pUL49通过FRK阻滞细胞周期于G1/S期。FRK阻滞细胞周期的其中一个机制是抑制细胞周期蛋白cyclin D1进入细胞核。我们在过表达pUL49的同时敲低FRK观察cyclinD1蛋白在细胞核内的分布情况,结果发现,pUL49过表达不影响cyclin D1蛋白的表达,但会使细胞核内的cyclin D1蛋白减少,细胞质中的cyclin D1蛋白增加,但同时敲低FRK使细胞核内的cyclin D1蛋白又会增加,相应地细胞质中的cyclin D1蛋白减少,说明pUL49调控U373宿主细胞的细胞周期是通过FRK调控cyclin D1的入核实现的。以高通量液相芯片技术检测若干调控细胞生长增殖的信号通路,发现pUL49过表达增加IRS-1(S636/S639)和P70S6K(T421/S424)蛋白的磷酸化,Western Blot进一步确定pUL49使IRS-1信号通路的IRS-1(S636/S639)、AKT(S473/T308)、PDK1(S241)、mTOR(S2448)、P70S6K(T421/S424)磷酸化。mTOR(S2448)、P70S6K(T421/S424)抑制剂均使细胞增殖进一步受到抑制,说明pUL49还需要通过IRS-1/AKT/mTOR/P70S6K信号通路来维持宿主细胞的生存。实验室前期研究表明缺失N端143个氨基酸后,pUL49的核定位可被影响,因此我们构建了pUL49及其缺失体pUL49(ΔN143)、pUL49(ΔN100)、pUL49(143)、pUL49(100)的真核表达载体。结果表明去除N端143个氨基酸后,pUL49(ΔN143)、pUL49(ΔN100)仍可使IRS-1(S636/S639)和P70S6K(T421/S424)磷酸化,证明pUL49蛋白的核定位对于IRS-1(S636/S639)和P70S6K(T421/S424)蛋白的磷酸化的调节不是必须的。总之,通过本课题研究,我们揭示了pUL49作为HCMV病毒的必须基因,通过FRK促使宿主细胞U373的细胞周期阻滞于G1/S期,从而抑制细胞的生长增殖,pUL49同时通过IRS-1/AKT/mTOR/P70S6K信号通路来维持宿主细胞的生存的分子机制。