阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是世界上主要的神经退行性疾病之一,临床表现为进行性记忆障碍、认知障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状,病理学表现为:细胞外淀粉样蛋白沉积形成的老年斑与细胞内神经纤维缠结。近年来,大量研究发现AD发病与多种因素有关,如遗传因素、环境因素、免疫学因素等。然而AD的致病机制尚不清楚,目前存在多种AD致病假说,其中比较公认的是淀粉样蛋白假说,该假说认为:在AD的发病过程中,关键因素是由Aβ寡聚体在脑内的沉积,其对周围的突触和神经元产生毒性作用,破坏突触膜,最终引起神经细胞死亡。Aβ是由APP经β-和γ-分泌酶顺序切割产生的小分子肽,因此对β-和γ-分泌酶的抑制成为AD治疗的首选方法。然而,迄今为止针对β-和γ-分泌酶的抑制剂的研究均以失败告终,故而目前研究重点转向β-和γ-分泌酶特异性调节剂和相互作用蛋白上。因此本课题以γ-分泌酶的催化亚基PS1为研究对象,从筛选其相互作用蛋白出发,进行了以下研究:1.基于免疫共沉淀和质谱相结合的方法,筛选PS1相互作用蛋白。用PS1抗体进行免疫共沉淀,将得到的蛋白进行质谱分析,发现PS1相互作用蛋白Rab21。在改进蛋白酶解方法的基础上,采用3种不同的PS1抗体进行免疫共沉淀和质谱检测,证实PS1与Rab21的相互作用。通过对质谱数据的分析,发现340种可能与PS1具有相互作用的蛋白,对这些蛋白进行GO聚类和KEGG信号通路分析,发现Rab21与其余19种蛋白聚类于具有GTPase活性的分类下,并且其中含有多种已报道的与AD相关的Rab蛋白,此结果说明PS1与内含体途径密切相关。2.生物学方法验证PS1与Rab21的相互作用。通过分子克隆的方法,成功以HeLa细胞cDNA为模板克隆出Rab21基因,并以pcDNA4-myc/his为载体构建Rab21真核表达质粒。在转染PS1和Rab21质粒的HEK293中,分别用PS1和Rab21的抗体进行免疫共沉淀,结果发现PS1与Rab21存在共沉淀。进一步采用细胞免疫荧光方法,发现Rab21与PS1在HEK293和SH-SY5Y中均存在共定位现象。以上两个结果证明了Rab21与PS1的相互作用。3.研究Rab21在APP水解过程中的作用。在20E2细胞中瞬时转染pcDNA4-Rab21后,APP-CTF减少,并且Aβ增多,说明Rab21影响APP水解过程。随后,在HEK293细胞中将APP-CTFs(C83、C89、C99)、PS1与pcDNA4或Rab21质粒共转,结果显示转染Rab21组APP-CTFs均有下降,说明Rab21可能通过影响γ-分泌酶对APP-CTFs的切割对APP水解过程产生影响。进一步在HEK293细胞中,通过共转C99和Rab21或shRab21,发现Rab21过表达促进γ-分泌酶水解C99产生Aβ40和Aβ42,而敲低Rab21结果相反,并且用荧光底物法检测到Rab21过表达使γ-分泌酶活性增高,而敲低Rab21使其活性降低;然而在20E2和2EB2细胞中过表达和敲低Rab21均不影响sAPP(total)、sAPPα和sAPPβ的蛋白水平,说明Rab21通过影响γ-分泌酶的活性而不是α-和β-分泌酶来调控APP水解过程。此部分结果证明Rab21通过调控γ-分泌酶的活性在APP水解过程中发挥作用。4.Rab21影响γ-分泌酶活性的机制研究。通过在HEK293细胞中过表达和敲低Rab21,研究其对γ-分泌酶表达水平的影响,发现Rab21对γ-分泌酶各亚基的蛋白水平和mRNA水平均无显著影响,说明Rab21对γ-分泌酶活性的调控不通过调控其表达水平产生。通过蔗糖密度梯度离心法分离亚细胞器,后进行Western Blot检测,发现在转染Rab21后,PS1-NT,PS1-CT在第5层的分布明显增加,而第5层中主要亚细胞成分为晚期内含体/溶酶体,据此推测Rab21可以改变γ-分泌酶的亚细胞分布,使其延长在晚期内含体的停留时间;进一步采用细胞免疫荧光的方法共转Rab21-EGFP和PSl-pdsRed质粒,发现转染Rab21后使PS1与Rab7和LAMP1共定位增多,说明Rab21使PS1向晚期内含体迁移;最后通过PS1内吞实验发现,Rab21可以促进细胞膜表面PS1向内含体的转移,即促进γ-分泌酶的内吞。此部分结果说明Rab21通过促进的γ-分泌酶的内吞及向晚期内含体的迁移来影响其活性。5.Rab21在AD病理进程中作用的初步探讨。通过研究Rab21在AD患者和AD转基因鼠脑中表达情况发现,AD患者脑内Rab21的mRNA和蛋白水平表达均较对照组均有上调,AD模型鼠不同脑区Rab21含量不同,海马和皮质区Rab21含量高于对照组,并且随着月龄的增长Rab21在AD模型鼠中的表达量增加,这些实验说明Rab21可能在AD进程中发挥作用。值得注意的是Rab21并不影响γ-分泌酶对Notch水解产生NICD的过程;这些结果提示Rab21可以作为候选AD治疗靶点。综上所述,本课题采用免疫共沉淀结合质谱这一高通量的方法,筛选出多种与PS1有相互作用的候选蛋白,并通过GO和KEGG通路分析,获得兴趣蛋白Rab21。采用多种细胞生物学和分子生物学手段验证了 Rab21与PS1蛋白的相互作用,及Rab21对APP水解切割过程的影响,并进一步探讨了 Rab21对γ-分泌酶活性调控的机制。本研究发现了多种PS1可能的相互作用蛋白,为进一步理解PS1和γ-分泌酶的功能提供了新的思路,而对Rab21的生物学功能的研究可以为Rab21作为潜在的AD治疗靶点提供理论基础。