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目的:瘢痕一直以来都是整形外科领域的一大难题。创伤后过度的修复会导致病理性瘢痕的形成,病理性瘢痕主要包括瘢痕疙瘩和增生性瘢痕。TGF-β1是伤口愈合后强有力的生长因子,被认为是瘢痕疙瘩和其他纤维化疾病的关键调控因子,TGF-β1与TGF-β受体结合后将激活信号传导到细胞核内,激发多种信号转导途径,来调控瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖过程。HTRA1是一种热激性蛋白,属于HTRA家族成员之一。研究发现,HTRA1在肿瘤中具有剪切细胞内TGF-β1前体进而抑制TGF-β1信号通路的作用。鉴于HTRA1为TGF-β1的抑制基因,且HTRA1的异常表达与众多肿瘤有关,尽管瘢痕疙瘩没有恶性征象,但其某些特征包括超出原有创伤范围、持续性生长并极易复发等又与恶性肿瘤有一定相似性。因此,本研究旨在首先明确HTRA1在瘢痕疙瘩中的表达水平、生物学功能以及潜在作用机制。然后在前期工作的基础上。进一步研究靶向HTRA1的miRNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞生物学功能的影响。方法:在HTRA1研究阶段,从组织水平,收集瘢痕疙瘩和正常皮肤组织各26例,应用RT-PCR、western blot和免疫组化技术检测HTRA1和TGF-β1的表达水平差异;从细胞内分子信号水平,应用细胞共培养、荧光素酶报告基因实验,研究HTRA1在瘢痕疙瘩形成过程中对TGF-β1活化的调控机制;应用慢病毒介导的基因沉默靶向抑制HTRA1或者TGF-β1,模拟靶向治疗瘢痕疙瘩的尝试,并研究HTRA1在瘢痕疙瘩中可能同时存在的TGF-β1非依赖调控机制;应用细胞衰老实验,研究HTRA1通过影响细胞衰老发挥TGF-β1非依赖的调控机制。在进一步研究HTRA1上游调控机制中,首先利用在线生物信息学软件(TargetScan,Pictar和MicroRNA)预测靶向HTRA1的miRNA,然后利用荧光素酶报告系统验证HTRA1是miR-494-3p的靶基因。在组织水平,应用RT-PCR检测miR-494-3p的表达水平。通过原代培养瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞,采用Lipofectamine 2000转染miR-494-3p mimic和miR-494-3p inhibitor,从而过表达miR-494-3p或降低miR-494-3p表达。MTT法检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞活力变化。流式细胞术检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡和细胞周期的变化。Transwell侵袭实验检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭能力的变化。Western blot实验检测miR-494-3p不同表达水平的瘢痕疙瘩成纤维细胞胶原合成能力的变化。结果:1、Real time PCR检测结果显示,HTRA1和TGF-β1在正常组织和瘢痕疙瘩中均表达,但HTRA1和TGF-β1的mRNA表达在瘢痕疙瘩中明显高于正常皮肤,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot和免疫组织化学染色均可以检测到瘢痕疙瘩和正常皮肤中HTRA1和活性TGF-β1的蛋白表达,但HTRA1和活性TGF-β1的表达在瘢痕疙瘩中明显高于正常皮肤,差异有统计学意义(P<0.05)。2、正常皮肤组织和瘢痕疙瘩中均可以检测到Smad2总蛋白以及磷酸化Smad2;和正常组织相比,瘢痕疙瘩Smad2总蛋白含量没有发生明显变化,磷酸化Smad2(p-Smad2)水平显著高于正常皮肤组织,差异有统计学意义(P<0.05)。荧光素酶报告基因结果显示,活性TGF-β1可以特异性的激活PAI-1启动子介导的荧光素酶基因表达而非活性TGF-β1则不能激活荧光素酶基因的表达。单独暴露于重组人HTRA1(rhHTRA1)或非活性TGF-β1的成纤维细胞中Smad2磷酸化水平和活性TGF-β1量均明显升高,rhHTRA1和latent TGF-β1共同处理进一步增强瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad2的磷酸化和活性TGF-β1的含量。3、干扰HTRA1或TGF-β1明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,干扰HTRA1比单独干扰下游TGF-β1对瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖具有更好的抑制效果。4、敲除HTRA1可以显著增强β-半乳糖苷酶活性,在基因敲除HTRA1的瘢痕疙瘩成纤维细胞中过表达S328A突变型HTRA1并未能逆转细胞衰老,抑制HTRA1而非TGF-β1能诱导成纤维细胞衰老。5、通过生物信息学分析我们发现瘢痕疙瘩成纤维细胞中HTRA1是miR-494-3p的潜在靶基因.荧光素酶活性结果显示,miR-494-3p能够与HTRA1 3’UTR上的结合位点结合而抑制荧光素酶的表达。6、miR-494-3p在正常皮肤组织和瘢痕疙瘩中均表达,在瘢痕疙瘩组织中的表达显著降低(P<0.05)。7、采用miR-494-3p mimic或miR-494-3p inhibitor处理瘢痕疙瘩成纤维细胞,我们发现24h后,瘢痕疙瘩细胞活力没有发生显著变化,而当培养48h和72h,miR-494-3p过表达明显抑制细胞活力,而抑制miR-494-3p则促进细胞活力,差异有统计学意义(P<0.05)。过表达miR-494-3p显著诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡,而抑制其表达能够降低瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡率(P<0.05)。细胞周期分析表明,过表达miR-494-3p引起细胞在G1期和S期细胞比例降低,G2期细胞所占比例升高;而抑制miR-494-3p则导致细胞在G1期比例升高,G2期比例降低。细胞侵袭实验显示,miR-494-3p过表达显著减少穿膜细胞数量,而干扰miR-494-3p表达则增加穿膜成纤维细胞数量。我们检测胶原蛋白含量发现,miR-494-3p过表达显著降低胶原蛋白I和III的表达水平,而干扰miR-494-3p表达则增强这两种蛋白表达量。结论:1、瘢痕疙瘩中的HTRA1表达升高,一方面通过依赖于TGF-β1的方式,活化前体TGF-β1,促进成纤维细胞复制,胶原蛋白合成,另一方面通过独立于TGF-β1的方式抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞衰老,来共同促进疾病的发展。2、瘢痕疙瘩中的miR-494-3p可以通过调控其靶基因HTRA1表达,发挥抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞活力,促进细胞凋亡和细胞周期阻滞,减少细胞侵袭和胶原蛋白合成能力,从而抑制疾病的发展,miR-494-3p有望成为瘢痕疙瘩治疗的新靶点。