研究背景白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病。在骨髓和其他造血组织中,白血病细胞失去进一步分化为成熟细胞的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。根据疾病的病程分为急性和慢性两大类。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, AL L)是一组起源于淋巴细胞(B系或T系)的造血系统恶性肿瘤性疾病,其特征为大量未成熟的淋巴细胞在骨髓中异常增生并聚集进而抑制正常造血。急性淋巴细胞白血病(简称急淋)在成人及儿童中均可发病,其发病高峰在2-5岁。近年来,联合化疗的应用使得儿童急淋的治愈率高达80%以上,但成人急淋的预后仍较差,缓解后极易复发。急性淋巴细胞白血病是一种异质性疾病,研究表明遗传学改变与急淋发生相关,最近研究发现表观遗传学改变在急淋发生中也发挥重要作用。视网膜母细胞瘤结合蛋白2(retinoblastoma binding protein-2, RBP2)又称作KDM5A或JARID1A,是JARID家族成员之一,具有组蛋白去甲基化酶的活性。RBP2可以使组蛋白H3上具有三甲基化和二甲基化标记的的第四位赖氨酸K4 (H3-K4)发生去甲基化。研究表明,RBP2可以通过影响细胞的增殖、衰老、分化在胃癌、肝癌及肺癌等实体瘤中促进肿瘤发生、EMT及侵袭转移等。然而,RBP2在血液系统疾病中的研究较少,我们的前期研究表明RBP2在慢性粒细胞性白血病急变中发挥抑癌作用。因此,RBP2在人类肿瘤的发生过程中发挥了促癌及抑癌的双重作用。RBP2是否在ALL的发生发展中发挥作用仍不清楚。慢性粒细胞白血病(CML)是以脾大、贫血和粒细胞增多为特征的骨髓增殖性疾病。人类9号和22号染色体易位t(9;22)(q34;q11)形成BCR-ABL融合基因,编码具有高度酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白介导慢粒发生。CML的疾病进程分为三个阶段：慢性期(CP)、加速期(AP)和急变期(BP)。酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是目前CML的一线治疗方案,主要包括第一代TKI伊马替尼,第二代TKI达沙替尼和尼罗替尼和第三代TKI普纳替尼等,TKIs对慢性期慢粒治疗效果好。然而,仍有约15%-20%的慢性期患者进展到急变期,还有10%-15%的患者初诊时已处于进展期。CML一旦急变,酪氨酸激酶抑制剂、化疗或两者联合使用均疗效差,病情凶险,预后极差。融合基因BCR-ABL的形成是CML发生的驱动因素,然而慢粒急变发生的分子学机制尚不清楚。研究发现,在CML急变演进过程中BCR-ABL仍然发挥了重要的作用。与此同时,许多研究还表明BCR-ABL非依赖的机制,如抑癌基因的失活以及促癌基因的激活等在CML急变中同样发挥了极其重要的作用。Yes相关蛋白1 (Yes-associated protein 1,YAP1)是Hippo通路中的重要分子,在发育过程及肿瘤发生中都发挥了重要作用。AP1主要与TEAD家族等转录激活基因结合进而调控下游靶基因的转录。YAP1在肿瘤中的作用存在争议,胃癌、肺癌以及肝癌中YAP1发挥促癌作用,而在结肠癌、乳腺癌以及多发性骨髓瘤中YAP1被证实可与PML、P73结合促进促凋亡基因的表达进而发挥抑癌作用。因此,YAP1在人类肿瘤发生过程中发挥促癌或抑癌作用,主要取决于组织的特异性。然而,YAP1在CML急变中的表达情况及作用尚不清楚。研究目的(一)探讨RBP2在成人急性淋巴细胞白血病中的作用和机制。(二)探讨YAP1在慢粒急变中的作用及机制。方法和结果(一)组蛋白去甲基化酶RBP2上调BCL2促进成人急性淋巴细胞白血病的发生1.RBP2在急性淋巴细胞白血病中表达升高：我们收集了42例初诊(ALL-denovo)、36例完全缓解(ALL-CR)、9例复发(ALL-relapse)的成人ALL患者以及33例缺铁性贫血病人(con)的骨髓样本。免疫荧光(IF)、Western Blot及qRT-PC R检测了RBP2的表达情况,结果显示：与对照组相比,初诊ALL的患者骨髓标本中RBP2的mRNA及蛋白水平升高约2倍；当治疗后达到完全缓解时RBP2的表达降低；疾病复发后RBP2表达又进一步升高,约为对照组的5倍。观察4例ALL患者在疾病进展过程中RBP2的表达变化,发现3例患者在疾病完全缓解后RBP2的表达与初诊时相比均有明显下降。2.RBP2敲除促进细胞凋亡、抑制细胞增殖：用RBP2-siRNA及RBP2-shRNA干扰急淋白血病细胞系RBP2的表达,流式细胞术检测显示细胞凋亡明显增加,克隆形成及EdU实验表明细胞增殖明显抑制。3.BCL2是RBP2的靶基因：用qRT-PCR及Western Blot方法发现急淋细胞系中干扰RBP2可以下调BCL2的mRNA水平及蛋白表达；干扰ALL患者骨髓原代细胞RBP2后BCL2的表达亦明显下调；同步检测ALL患者骨髓标本中RBP2及BCL2表达水平后发现两者表达呈现明显正相关。这些结果表明BCL2是RBP2的重要靶基因。进一步用双荧光素酶活性检测证实了干扰RBP2可以使BCL2启动子活性下降。CHIP实验结果显示RBP2可以结合于BCL2启动子的b区域,而不能与a或c区域结合。4.RBP2调控凋亡和增殖依赖于对BCL2的调控：将BCL2高表达后,RBP2敲除所诱导的凋亡增加及增殖抑制被部分逆转；RBP2敲除与BCL2抑制剂ABT-199联合应用细胞凋亡明显增加,表明两者具有协同抗白血病效应。(二)YAP1调控PDCD4在慢粒急变中发挥抑癌作用1.YAP1在CML急变中低表达：通过对GEO数据库中CML芯片结果进行分析发现CML急变期病人中YAP1的表达比慢性期降低50%左右；qRT-PCR及免疫荧光检测38例CML慢性期以及21例急变期病人骨髓标本中的YAP1的表达,证实了CML急变过程中YAP1的表达较慢性期明显降低,mRNA水平较慢性期降低了约65%。2.YAP1促进慢粒急变细胞凋亡和分化：细胞水平研究,用EdU和流式细胞术检测观察到YAP1高表达可以促进细胞凋亡、抑制细胞生长；并且可以促进Bax、P21等P73下游基因的表达。用诱导分化剂PMA诱导CML细胞系K562及MEG-01向巨核系分化后,YAP1的表达显著升高；将YAP1高表达后巨核系分化标志CD61表达明显增加,并且与PMA具有协同诱导CML细胞分化的能力。3.YAP1调控PDCD4的表达：qRT-PCR和Western Blot检测YAP1高表达后下游基因的表达,结果显示YAP1可以调控CML急变过程中参与细胞分化的重要分子PDCD4而不影响BCR-ABL的表达。4.YAP1在CML急变中受到表观遗传机制的调控：DNA甲基化抑制剂地西他滨(decitabine)以及组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂西达本胺(chidabine)处理慢粒急变细胞后,YAP1表达升高。因此,YAP1可能受到表观遗传机制的调控。研究结论本文通过对RBP2及YAP1这两个具有转录调控作用的分子在成人白血病中的研究发现：RBP2在ALL发生及发展过程中通过调控BCL2发挥促癌作用；YAP1在CML急变过程中表达降低,通过促进细胞凋亡及细胞分化发挥了抑癌作用。这些发现表明RBP2及YAP1的异常表达对于疾病的诊断有提示意义,可作为白血病诊断、治疗及监测疾病进展的潜在靶点。