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研究背景:胃癌是我国消化道肿瘤中最常见的肿瘤之一,它的发病率高,早期检出率低,恶性程度高,治疗效果差,生存期短,预后差。另外近期发现胃癌的发病有逐渐年轻化的特征,胃癌已经成为对我国人群健康有严重威胁的主要公共卫生问题之一,目前我国的人口结构已发生较大变化,随着人均寿命的延长,老龄化的现象逐渐增加,环境污染、饮食及生活方式不健康,同时有幽门螺旋杆菌慢性感染等多种危险因素累加,防控形势非常严峻,胃癌越来越引起人们的重视。胃癌的形成是一个动态的过程,包括多种基因激活或失活、多步骤、多阶段完成,在其发展的不同阶段中有不同的组分、基因等参与其中,在胃癌发生发展的不同阶段和过程有不同的组分参与在其中,对这其中可能涉及到的分子或信号通路机制进行研究,有利于我们更好地去了解胃癌的发病机制、进展过程。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类单链小RNA,目前发现广泛存在于多种生物的体内,其序列长度约20～25个核苷酸,不编码蛋白质。成熟的microRNA能够通过识别特定靶基因的3,端非编码区(UTR),并与之完全或不完全性结合,而抑制相应蛋白的合成或诱导相应靶基因的降解,对靶基因的表达起负性调控的作用。microRNA参与多种生命过程,如胚胎的发育、细胞的增殖与分化,细胞的凋亡等等。研究发现,肿瘤细胞的microRNA表达谱和正常细胞相比,差异较明显,推测其可能在肿瘤的形成过程中起重要作用。microRNA可作为一种癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展的整个过程,同时也影响肿瘤治疗的结果,影响预后。因此我们推测对microRNA的研究可以为肿瘤的诊断、治疗及判断预后提供了新的靶点。miR-17-92癌基因位于13q31染色体的C13orf25的内含子,它编码miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1 和miR-92-1 等7个microRNA。研究发现miR-17-92基因簇在多种肿瘤中表达异常,与肿瘤的增殖转移关系密切,同样也有癌基因和抑癌基因的双重作用。miR-19a/b是miR-17-92基因簇中最重要的microRNA,已在多种肿瘤中被发现与肿瘤的增殖、侵袭、转移能力有关。NF-kB(nuclear factor-kB)是一种转录因子,其广泛存在于多种类型的细胞中,目前发现大量的细胞免疫应急反应都有其参与调节,如炎症反应、细胞免疫应答、与细胞抗凋亡基因的转录等。最近几年,microRNA被认为是NF-kB信号途径的重要调控因子。我们的研究主要在于miR-19a对NF-kB激活的影响及miR-19a对胃癌细胞增殖的影响。研究方法:第一部分:miR-19a在胃癌细胞及胃癌组织中的表达情况及其与临床参数相关性的研究目的:研究miR-19a在3种胃癌细胞系、胃癌组织及癌旁组织中的表达情况,同时研究其表达量与临床病理参数关系。方法:细胞培养胃癌细胞系MGC-803,BGC-823和SGC-7901,以正常胃黏膜上皮细胞GES-1做对照,应用RT-qPCR方法检测4种细胞中miR-19a的表达情况。同样应用RT-qPCR方法检测30例胃癌组织及对应癌旁组织中miR-19a的表达,同时分析其表达与各临床病理参数的相关性。结果:miR-19a水平在人胃癌细胞中上调。RT-qPCR检测人胃癌细胞中miR-19a的相对水平。与GES-1胃黏膜上皮细胞相比,MGC-803,BGC-823和SGC-7901人胃癌细胞系的miR-19a水平显著升高(>1倍),其中,MGC-803细胞中miR-19a的表达水平最高。miR-19a表达水平用U6标化(P<0.05)。基于这些结果,人胃癌细胞中miR-19a的水平显著增加。胃癌组织中miR-19a的表达水平显著高于对应癌旁组织,miR-19a的表达水平与病人的年龄、性别、肿块大小、分化程度、肿瘤浸润程度无关,与肿瘤分期及有无淋巴结转移相关。第二部分:miR-19a增强MGC-803细胞的增殖能力目的:研究miR-19a对胃癌细胞MGC-803细胞增殖能力的影响。方法:选择miR-19a表达最高的MGC-803细胞,分别用miR-19a mimics、inhibitor或NC对MGC-803细胞转染24,48或72小时。MTT法用于检测miR-19a对细胞增殖能力的影响。结果:miR-19a mimics染到MGC-803人胃癌细胞系中时,细胞增殖能力在转染24、48、72小时后均上升,其中在48和72小时分别增加了 23%和35%。相反,当miR-19a的表达被抑制时,细胞增殖能力均下降,其中在48和72小时下分别降17和36%。这些结果表明miR-19a可以增加MGC-803细胞增殖能力。第三部分:TNF-α促进miR-19a表达升高,miR-19a激活NF-kB信号通路,促进胃癌细胞的增殖目的:研究TNF-α对miR-19a表达的影响,同时观察miR-19a能否通过激活NF-kB信号通路而起作用。方法:1.10ng/ul TNF-α 处理 MGC-803 细胞 48h 后,应用 RT-qPCR 方法检测 miR-19a的相对水平的变化,应用western-blot检测p-NF-kB及NF-kB蛋白水平的变化。2.为了检测miR-19a是否有助于NF-kB活化,我们将miR-19a mimics转染MGC-803 细胞,应用 western-blot 检测 p-NF-kB、NF-kB、VCAM-1,ICAM-1 和 MCP-1的蛋白水平的变化。免疫荧光检测NF-kB蛋白表达的变化。3.为了研究NF-kB对细胞增殖的影响,选择了小干扰RNA(siRNA)靶向NF-kB,分别将 si-NF-kB 及 si-NF-kB 和 miR-19a mimics 共转染 MGC-803 细胞,应用western-blot检测NF-kB、VCAM-1,ICAM-1和MCP-1的蛋白水平的变化;应用MTT检测细胞增殖能力的变化。结果:1.MGC-803胃癌细胞用10 ng/ul TNF-α处理48小时,RT-qPCR方法分析miR-19a的相对水平增加约4倍。同时western-blot检测p-NF-kB及NF-kB蛋白表达,发现与对照组相比,二者表达均升高。2.MGC-803胃癌细胞用miR-19a模拟物进行转染后,western-blot检测发现,与阴性对照相比,磷酸化NF-kB/NF-kB 比值增加1倍以上,血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)蛋白水平升高,其相对水平均升高至1倍。细胞免疫荧光显示:转染miR-19a mimics后,NF-kB的表达增强。3.转染si-RNA靶向NF-kB后,即使在用miR-19a模拟物转染的细胞中,细胞活力也显著降低。MTT测定显示,用si-NF-kB转染的细胞,细胞活力显著降低,共转染后,细胞活力有升高,但仍较空白对照组低。同样,Western blot方法检测NF-kB、VCAM-1、ICAM-1、MCP-1蛋白表达情况,单独转染si-NF-kB组水平最低,共转染组升高,但仍较对照组含量低。结论:胃癌细胞中miR-19a表达升高,其通过NF-kB途径的激活介导胃癌细胞的增殖。胃癌组织中miR-19a的表达高于癌旁组织,且与肿瘤分期及淋巴结转移相关。