【摘 要】
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滇重楼是传统药用植物,野生资源匮乏。人工种植是解决滇重楼药源紧缺的有效途径,但许多人工种植品存在品质下降的问题。利用内生菌保障和改良中药植物品质是当前研究的热点之一。本研究以人工种植的5年生滇重楼为对象,采用Illumina Miseq测序技术和微生物培养技术分别分析根茎、茎和叶3种组织总内生真菌及可培养内生真菌的多样性及菌群特征,以及分析与重楼皂苷含量相关的内生真菌(属);通过与小麦幼苗共培养筛
【基金项目】
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国家自然科学基金资助项目(No.31370118;31770134); 中南民族大学基本科研业务费专项资金资助项目(CZT18005,18006,18007); “武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室建设”基金项目(2018BFC360); 中南民族大学研究生创新创业基金项目(3212020sycxjj271)
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滇重楼是传统药用植物,野生资源匮乏。人工种植是解决滇重楼药源紧缺的有效途径,但许多人工种植品存在品质下降的问题。利用内生菌保障和改良中药植物品质是当前研究的热点之一。本研究以人工种植的5年生滇重楼为对象,采用Illumina Miseq测序技术和微生物培养技术分别分析根茎、茎和叶3种组织总内生真菌及可培养内生真菌的多样性及菌群特征,以及分析与重楼皂苷含量相关的内生真菌(属);通过与小麦幼苗共培养筛选具促生作用的内生细菌,并通过检测促生菌对黄芪幼苗的生长及生理指标的影响,初步揭示内生细菌促进黄芪生长的生理机制,为后期利用内生菌保障和改良滇重楼品质的研究提供参考。主要结果如下:(1)基于ITS序列分析了5年生滇重楼的根茎、茎和叶3种组织的总内生真菌的多样性及结构组成。在97%序列相似度水平下,将388253条有效序列归属为722个OTU,进一步归类到5个门,12个纲,30个目,44个科,50个属。根茎的总内生真菌丰富度高于茎和叶。3个组织共有内生真菌归属到6个属;根茎、茎和叶的特有内生真菌分别归属到11个、5个和4个属。根茎、茎和叶的总内生真菌优势属分别为支顶孢属(5.8%)、Papiliotrema(1.1%)和Microidium(0.4%)。总内生真菌之间“协同”关系(62.5%)大于“竞争”关系。进一步分析总内生真菌和重楼皂苷含量的相关性,发现分别有6、3、3和7个真菌属(相对丰度)与重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ含量呈显著正相关。(2)采用微生物培养技术分析5年生滇重楼三个组织的内生真菌的组成及分布。分别从根茎、茎、叶3种组织分离和纯化可培养内生真菌,并克隆和测序了其中199株(包括分离自茎组织的71株、根茎组织的65株、叶组织的63株)内生真菌的18S r DNA序列。可培养内生真菌的多样性表现为:根茎>茎>叶。根茎、茎、叶3种组织的可培养内生真菌的优势属均为曲霉属,其相对丰度分别为63%、49%、68%。根茎和茎的可培养内生真菌组成最相似。3种组织共有的可培养内生真菌归类到4个属,根茎、茎和叶特有的可培养内生真菌分别归类到4个、1个和1个属。可培养内生真菌共有6个属和2个属分别与3种重楼皂苷含量呈正相关和负相关。(3)通过与小麦幼苗共培养,从300株内生细菌中筛选得到18株具促生作用的菌株。选择促生效果明显的YNR32041和YNR32058菌株分别与黄芪幼苗共培养,发现这2株内生细菌对黄芪幼苗的生长具有促进作用。与YNR32041共培养的黄芪幼苗在第10 d时,其株高、根长生长迅速,增长率分别为118.8%、113.6%;第15 d时,其鲜重促进效果最显著,增长率为206.2%。与YNR32058共培养的黄芪幼苗在第10 d时,其株高和根长生长迅速,增长率分别为190.4%和257%,第15 d时,其鲜重促进效果最显著,增长率为380%。(4)分别检测与YNR32041和YNR32058共培养不同时间点的黄芪幼苗的10个生理生化指标,发现在本研究选择的检测时间点内,与YNR32041共培养的黄芪幼苗与对照相比,第10 d时淀粉含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、ZT含量和ACC活性变化明显,其增长率分别为62%、57.1%、20.8%、28.9%和25.6%,而MDA含量在第15 d时增长率为227%;ABA含量在第15 d时显著降低43.5%,其他生理指标与对照相比均无显著差异。与YNR32058共培养的黄芪幼苗与对照相比,第10 d时ZT含量和ACC活性变化明显,增长率分别为21.1%和21.5%,MDA含量在第5 d时增长率为25.2%;淀粉含量在第10 d时显著降低71%,可溶性糖含量在第15 d时显著降低88%,其他生理指标与对照相比均无显著差异。这些结果初步揭示了两株内生细菌促进黄芪幼苗生长的生理机制。
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