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植物抗病基因的研究一直是植物分子生物学研究的热点之一,到目前为止已分离了近70个植物抗病基因。水稻中已经鉴定32个主效抗白叶枯病基因,其中Xa1、xa5、xa13、Xa21、Xa26和Xa27近年已被分离克隆。在众多的水稻抗白叶枯病基因中,被育种利用的并不多。所以克隆和研究新的抗白叶枯病基因是水稻抗病研究的客观要求。从我国普通野生稻中鉴定发掘的Xa23基因,具有抗谱广、完全显性、全生育期抗性等特点,并已培育成以金刚30（JG30）为背景的近等基因系CBB23。 本研究利用JG30与CBB23杂交F2代的2562个单株为作图群体,对Xa23基因进行精细定位;BAC文库构建;Shotgun文库测序;遗传转化等方法克隆Xa23基因。主要结果如下: 1.EST分子标记定位:根据日本水稻基因组计划RGP的数据,筛选并合成12个EST标记的引物,进行亲本间多态性检测。找到2个在CBB23与JG30间有多态性的标记C189和CP02662。用C189标记对F2群体中的571个感病单株进行分子检测和连锁分析,结果表明该标记与Xa23的遗传距离为0.8cM。将C189成功用于水稻分子育种实践,标记辅助选择的正确率接近100%。 2.利用相关基因组文库进行分子标记定位:通过筛选水稻明恢63的TAC文库和广陆矮4号的PAC文库,获得15个末端片段,其中6个末端片段在双亲间有多态性,分别为69B、81N、45B、45N、84N和84B。这些标记与Xa23的遗传距离依次为0.4、0.4、0.5、0.6、0.6和1.1 cM。加密了Xa23基因一侧的遗传图谱,并使其遗传距离缩短到0.4 cM。 3.开发新的PCR标记进行Xa23基因精细定位:依据国际水稻基因组计划测序的水稻品种日本晴的序列及上述定位的区域为依据设计特异引物,共开发出8个新的分子标记Lj13、Lj36、Lj46、Lj55、Lj204（Lj74）、Lj210、Lj211和Lj215。用这些标记对F2群体感病单株进行分子检测和连锁分析,标记Lj36、Lj46和Lj211与Xa23的遗传距离分别为0.4cM、0.3cM和0.2cM,位于同一侧,Lj13与Xa23的遗传距离为1.1cM,位于基因另一侧,Lj204（Lj74）、Lj210、Lj215和Lj55与Xa23的遗传距离为0cM,与Xa23基因共分离。 4.构建了CBB23 CopyControl pCC1 BAC文库,该文库包含36,096个克隆,平均插入片段108Kb,覆盖水稻基因组9.1倍。用紧密连锁标记Lj211和共分离标记Lj74筛选BAC文库,得到5个阳性克隆64F16、71H3、91A1、6O8和59F8,建立了跨叠克隆群,将Xa23基因锁定在BAC克隆6O8内,经脉冲电泳检测其插入片段为80Kb左右。 5.对BAC克隆6O8进行鸟枪法（Shotgun）全序列测定,成功获得72115bp的DNA连续序列。通过基因预测共有12个开放阅读框（ORFs）,分别编码不同的基因,根据ORF编码产物的同源性比较以及分子标记的位置,最后锁定6个ORFs为侯选基因。 6.运用农杆菌介导转化法将选取的10个侯选基因克隆载体转化到受体品种中,共得到1350株转基因苗。其中侯选基因载体T189转化受体牡丹江的258株T0代转基因苗,经田间接种鉴定,有23株表现抗病,其中17株表现高抗,6株表现中抗。其它侯选基因克隆的转基因苗对小种P6都表现感病。潮霉素基因Southern杂交检测抗病株拷贝数,高抗和中抗中既有单拷贝又有双拷贝,证明所有抗病株都是转基因。结果表明T189含有的基因就是本研究所克隆的目标基因Xa23,成功克隆Xa23基因。 7.BlastX分析表明,Xa23基因与已知的其它已克隆的植物抗病基因都不同源,说明Xa23基因是一类新型的抗病基因。