牙周病引起牙周组织破坏,如果未得到及时的治疗,最终将导致牙齿的缺失。牙周炎引起的牙齿支持组织不足,可严重影响牙齿的功能。目前牙周炎的治疗主要包括洁治、刮治,但对于牙周骨组织的高度恢复还有赖于组织再生材料。诱导牙周组织再生的方法包括引导骨组织、软组织再生及各类生长因子或者基因治疗等。其中,引导骨组织再生已经被广泛运用,取得了肯定疗效,近几年也一直是一个研究热点。引导组织再生(Guided tissue regeneration, GTR)膜是牙周组织再生材料中不可缺少的一部分。GTR膜的主要作用是将牙龈上皮组织阻挡在外,允许牙周膜来源或者成骨源性的细胞优先占领修复区域,也为下方的人工替代材料维持一定的空间。因此,GTR膜应当具备一定的机械强度及生物相容性。静电纺丝形成的纤维膜的机械性能及结构特点基本能复合这类要求,并且已被证明是一种适宜组织生长良好材料。目前用于静电纺丝纤维制备的材料主要有壳聚糖、聚乳酸、胶原、PLGA等。但由单一材料制备的纤维,结构单一,功能简单,复合了多种材料的纤维,功能更为全面,能同时达到促进细胞增殖、抗炎、抗菌等功能。研究表明,人工材料有可能导致周围组织的炎症,因此尚需改进。通过结合靶向调控细胞信号传导的药物,有目的地调控细胞的功能状态,成了这一研发的新方向。细胞膜表面受体介导胞内的信号分子转导,对细胞的功能状态起决定性作用。在众多的细胞膜受体中,TLR4对细胞的增殖、矿化、炎症因子表达都起到重要作用。这些作用与组织工程材料的功能息息相关,因此,材料通过结合靶向调控TLR4的药物,改善材料的功能,有一定的可行性。本实验的目的是制备聚乳酸静电纺丝纤维,并且经壳聚糖表面修饰探讨该纤维的机械性能变化；并添加纳米银研究对牙龈卟啉单胞菌的抑菌性；对于骨髓基质干细胞增殖、矿化的影响及对牙周膜细胞炎症因子表达的影响。并初步探索纺丝纤维对牙周膜细胞炎症因子表达的影响,及TLR4信号通路在其中的作用,为后期结合靶向调控TLR4表达的药物做准备。第一章聚乳酸/壳聚糖/纳米银纺丝纤维的制备目的采用静电纺丝技术制备聚乳酸/壳聚糖/纳米银纺丝纤维,在扫描电镜下观察纤维结构,并在纤维的正反面分别喷上壳聚糖溶液及纳米银颗粒,观察壳聚糖存在形态及纳米银在纤维表面的分布。在能谱仪上检测银元素含量。方法1.将聚乳酸溶解在三氯甲烷中进行电纺,真空干燥过夜。壳聚糖通过静电纺丝技术喷涂到纯聚乳酸膜上,再次真空干燥。将纳米银以1mg/mL超声分散喷洒在壳聚糖膜的另外一面,风干。2.在纤维表面喷金后,扫描电镜观察表面形态,计算直径。观察壳聚糖及纳米银纳米颗粒在材料上的分布情况。3.聚乳酸表面喷洒上纳米银纳米粒后,在能谱仪下选取纳米银纳米粒分布区域,检测该区域银元素的含量。结果1.扫描电镜图像显示纯聚乳酸纤维表面呈网状结构,纤维直径约500nm到1.3μm。壳聚糖以纳米颗粒的形式分散在聚乳酸纤维上,壳聚糖比例增加,壳聚糖纳米粒相互融合。2.纳米银以纳米颗粒的形式分散在壳聚糖的另一面。能谱结果显示银元素含量大约33%。第二章聚乳酸/壳聚糖/纳米银纺丝纤维的机械性能研究目的检测制备聚乳酸/壳聚糖/纳米银纺丝纤维的机械性能如弹性模量、断裂伸长率以判断该材料是否能满足临床的需要；检测水的接触角,以观察壳聚糖涂层对材料亲水性的影响,初步判断对细胞亲和性能的影响；检测材料的降解性能,以了解该材料的降解速率。方法1.断裂伸长率、弹性模量：将4组静电纺丝纤维剪成1mm×20mm的规格,每组样品20个,置于力学拉伸机上行单轴拉伸试验,检测弹性模量,断裂伸长率。2.接触角检测：将4组静电纺丝纤维剪成5mm×5mm的规格,每组样品10个。滴加墨水稀释液,在立体显微镜下进行摄影,取30秒的图像进行统计。3.降解性能检测：将4组静电纺丝纤维剪成50mg每张,放置在50mL PBS缓冲液中,37℃孵育。在预定的时间点换液,干燥并称重。4.统计学分析：所得数据用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析,检验水准α=0.05；进行方差分析前,先行Levene方差齐性检验。对方差齐性的资料采用Bonferroni法进行多重比较,方差不齐的资料用Dunnett’s T3法进行多重比较。结果1.机械性能结果显示：纯聚乳酸纺丝经壳聚糖表面改性后,弹性、断裂伸长率有所上升。2.接触角结果显示：纯聚乳酸呈现明显的疏水性,接触角大,经壳聚糖改性后,亲水性提高,接触角变小。3.降解性能检测：纯聚乳酸降解性小,经壳聚糖改性后,降解性增加,并且随壳聚糖比例的增加而增加。第三章聚乳酸/壳聚糖/纳米银纺丝纤维的生物学性能研究目的研究聚乳酸/壳聚糖/纳米银的聚乳酸/壳聚糖纤维面对骨髓基质干细胞增殖、矿化的影响；对牙龈卟啉单胞菌的抑菌增殖的影响；对人牙周膜细胞炎症因子表达的影响。探索制备的纺丝纤维的各项生物学性能。方法1.纳米银颗粒最小抑菌溶度检测：纳米银颗粒以20μg/mL、30μg/mL、 50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL分散于营养肉汤中。牙龈卟啉单胞菌以一定密度加入,37℃中孵育。酶标仪法测纳米银最小抑菌溶度。2.聚乳酸/壳聚糖/纳米银抑菌率的检测：静电纺丝纤维膜剪成直径约10mm的圆形。按照纳米银测定的最低抑菌溶度制备纳米银/肉汤混合液并分别加入纯聚乳酸、聚乳酸/壳聚糖(1/9、3/7、5/5)的静电纺丝纤维,以纯营养肉汤为参照。酶标仪法测抑菌性。3.聚乳酸/壳聚糖/纳米银对骨髓基质干细胞增殖的影响：静电纺丝纤维膜剪成直径约10mm的圆形。细胞以一定密度接种,分组：纯聚乳酸,壳聚糖/聚乳酸膜(1/9、3/7、5/5),细胞直接接种在24孔板为参照。培养箱中培养1、3、5、7天用MTT法检测细胞增殖。4.聚乳酸/壳聚糖/纳米银对骨髓基质干细胞矿化的影响：细胞以一定密度接种,分组：纯聚乳酸,壳聚糖/聚乳酸膜(1/9、3/7、5/5),以细胞直接接种在24孔板为参照。37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养14天用茜素红染色法检测细胞矿化情况。RT-PCR检测OPG与RUNX2 mRNA表达。5.牙周膜细胞培养：取18-24岁牙周及牙体均健康志愿者的智齿,无菌条件下刮取根中1/3牙周膜,改良酶消化法进行原代培养并传代。取原代及培养至第3代的细胞,倒置相差显微镜观察获取图片。6.角蛋白、波形丝蛋白染色：取对数生长期的第三代hPDLCs以一定密度接种至底部放有载玻片的24孔细胞培养板。24小时后PBS冲洗3次,多聚甲醛固定30分钟,取出载玻片进行角蛋白、波形丝蛋白染色。7.MTT法检测hPDL壳聚糖的细胞活性：取对数生长期的第三代hPDLCs以一定密度接种至96孔板。于1天、3天、5天、7天加入20μL MTT液,37℃避光孵育4小时；吸弃原液,每孔加入150μL二甲基亚砜,酶联免疫检测仪上测定各孔OD值(波长490 nnm),绘制生长曲线。8.聚乳酸/壳聚糖/纳米银对牙周膜细胞炎症因子表达影响：静电纺丝纤维膜剪成直径约10mm的圆形。接种细胞,分组：纯聚乳酸,壳聚糖/聚乳酸膜(1/9、3/7、5/5),以细胞直接接种在24孔板为参照。第7天提取细胞总mRNA,实时荧光定量PCR检测炎症相关基因的表达。9.统计学分析：所得数据用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析,检验水准α=0.05;进行方差分析前,先行Levene方差齐性检验；对方差齐性的资料采用Bonferroni法进行多重比较,方差不齐的资料用Dunnett’s T3法进行多重比较。结果1.抑菌结果显示：纳米银颗粒50μg/mL抑菌率约90%,差异具有统计学意义。2.聚乳酸/壳聚糖/纳米银抑菌率的检测：不同比例组成的静电纺丝纤维与纳米银混合后,不降低纳米银的抑菌率。3.MTT结果显示：骨髓基质干细胞在支架材料上能以比较快的速度增长,其中在第1天、3天与空白对照组OD值有明显的升高,第5天、7天实验组与空白对照组相比增殖速率均在75%以上,属于无毒性材料。4.骨髓基质干细胞矿化结节染色结果显示：聚乳酸／纳米银纤维与空白对照组无明显的矿化结节形成,经壳聚糖改性后,矿化结节形成明显增加,并且随壳聚糖比例的增加有所增加。经壳聚糖表面改性后,矿化基因的表达比纯聚乳酸/纳米银及空白对照组明显增加。5.原代hPDLCs培养：改良酶消化法分离培养hPDLCs 6-9天可见细胞游离出组织块。形态学观察显示：游出细胞为典型成纤维细胞样细胞,细胞为梭形或星形,体积较大。传代细胞为不规则圆形、多角形、梭形,且成放射状增殖。6. hPDLCs鉴定：波形丝蛋白胞浆呈阳性着色,而角蛋白为阴性,表明细胞较为单一,无上皮细胞的污染,且为间充质来源。7. hPDLCs增殖：hPDLCs增殖呈典型的“S”型,接种3天后细胞增长快速,7天的时候处于平台期,符合成纤维细胞生长规律。8. hPDLCs炎症因子表达：纺丝纤维可促进牙周膜细胞TLR4、IL-6、IL-8、 IL-1β mRNA表达。第四章聚乳酸/壳聚糖/纳米银纺丝纤维促炎反应机制的初步探讨目的观察TLR4的沉默对细胞MyD88/NF-κB及炎症因子表达的影响。并探索TLR4沉默对接种于支架材料的牙周膜细胞炎症因子表达的影响。以探索结合靶向调控TLR4表达的药物的可行性。方法1.TLR4慢病毒表达载体的构建及细胞感染：将含有目的序列的穿梭质粒及三种辅助包装质粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G,利用RNAi-mate进行共转染293T细胞,培养72小时,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,离心后得到高滴度的慢病毒浓缩液。通过GFP荧光细胞计数法测定浓缩病毒液的滴度。2.TLR4沉默效率检测：取状态良好、对数生长阶段的第3代hPDLCs接种于6孔板,24小时细胞贴壁后随机分4组,分别加入2μL的polybrene和剂量的慢病毒(MOI=50、MOI=80)。第4天经RT-PCR及Western Blot检测TLR4表达。3.TLR4沉默对MyD88、NF-κB表达影响：按上述方法培养牙周膜细胞转染慢病毒(MOI=50MOI=80)。RT-PCR及Western Blot检测MyD88、NF-κB表达。4.TLR4沉默对hPDLCs炎症因子表达的影响：按上述方法培养牙周膜细胞转染慢病毒(MOI=50、MOI=80)。RT-PCR检测IL-1、IL-6、IL-1β表达。5.TLR4沉默对静电纺丝纤维导致炎症因子过表达影响：静电纺丝纤维膜剪成直径约10mm的圆形,接种细胞。阴性对照组：纯聚乳酸/纳米银,壳聚糖/聚乳酸(1/9、3/7、5/5)/纳米银,第2天加入NC-shRNA;实验组：纯聚乳酸/纳米银,壳聚糖/聚乳酸(1/9、3/7/5：5)/纳米银,加入TLR4-shRNA。第7天提取细胞总mRNA,实时荧光定量PCR检测炎症相关基因的表达。6.统计学分析：所得数据用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析,检验水准α=0.05；进行方差分析前,先行Levene方差齐性检验；对方差齐性的资料采用Bonferroni法进行多重比较,方差不齐的资料用Dunnett’s T3法进行多重比较。结果1.慢病毒滴度检测结果：TLR4-shRNA及NC-shRNA慢病毒滴度均为109TU/mL。2.TLR4沉默效率的检测：慢病毒转染人牙周膜细胞48小时,可见细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光；RT-PCR及Western Blot显示构建的慢病毒能有效沉默TLR4 mRNA及蛋白表达。3. MyD88、NF-κB检测：RT-PCR及Western Blot显示TLR4沉默后可直接下调MyD88、NF-κB mRNA及蛋白表达。4. hPDLCs炎症因子检测：RT-PCR结果显示TLR4沉默后可直接下调IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的表达。5.TLR4沉默对纺丝纤维促炎作用的影响：RT-PCR结果显示TLR4沉默后可下调静电纺丝纤维引起的牙周膜细胞TLR4、IL-6、IL-8、IL-1βmRNA表达升高。结论1.制备的聚乳酸静电纺丝纤维直径均匀,壳聚糖低比例时以纳米颗粒的形式分布,高比例时互相融合。纳米银纳米粒均匀分布于聚乳酸表面。2.聚乳酸/壳聚糖纤维膜机械性能基本满足临床需求,壳聚糖涂层可提高材料的机械性能、降解速度及亲水性能。3.制备的材料生物学性能良好,可促进细胞早期增殖；壳聚糖涂层可促进细胞矿化；纳米银最低抑菌浓度为50μg/mL;聚乳酸/壳聚糖/纳米银混合材料可促进炎症因子表达。4.TLR4在静电纺丝引起的炎症反应,具有一定作用,可能可以通过添加TLR4受体调控药物,抑制纺丝纤维引起的炎症反应。