结合双光子技术与激光共聚焦显微镜的双光子荧光成像技术是一种新型荧光成像技术,在生物成像时具有组织穿透能力深,背景荧光干扰小,时空分辨率高等优点。尽管双光子荧光成像探针得到了一定发展,但是常规策略设计的双光子荧光分子探针往往只通过单一信号机理调控双光子荧光团发光存在信噪比不高的缺点,导致灵敏度和成像对比度难以满足生物体内低丰度生物活性物质检测与生物成像要求。因此,本论文以发展新型双光子荧光探针为研究切入点,利用双重信号响应机理协同调控双光子荧光团发光性能,发展通用且高效的双光子荧光探针设计策略,并应用于活体组织内半胱氨酸高灵敏成像示踪分析。具体工作开展如下:(1)分子内电荷转移(ICT)和双光子荧光共振能量转移(TP-FRET)双机制协同调控双光子比率型荧光分子构建。通过理性设计,构筑了以双光子染料苯并-[h]色烯为荧光能量转移供体,具有ICT性质的苯并恶二唑为荧光能量转移受体的系列结构杂交化合物。尝试通过调控ICT强弱引发受体吸收波长的偏移,从而调节双光子供体发射和受体吸收之间的光谱重叠水平,从而影响TP-FRET过程,产生比率型双光子荧光信号变化。(2)半胱氨酸(Cys)作为生物体内一种重要的小分子硫醇化合物,其在蛋白质的合成中起着不可或缺的作用,并且生物体内Cys含量的高低也与许多疾病有诸多的联系。本工作以筛选所得的苯并-[h]色烯为双光子荧光团,氯代苯并二唑衍生物为能量受体和Cys识别位点的ICT介导TP-FRET型双光子比率荧光探针TP-Ratio-Cl,用于高分辨率,高灵敏度和特异性检测成像生物体组织中Cys含量的变化。