目前已知的蜘蛛种类有42000多种,几乎每一种蜘蛛都能够纺丝,圆网蜘蛛甚至能织七种不同的丝纤维。这些蛛丝纤维主要由蛋白质构成,被称为蛛丝蛋白,其基因结构高度保守。蛛丝中强度最高的一种丝称为主壶腹腺丝(拖丝),被认为是自然界中最坚韧的生物聚合物之一,它构成了蜘蛛网的框架,也是蜘蛛从高处跳落躲避捕食者时所纺出的丝纤维。另一种特殊的蛛丝为梨状腺丝,由梨状腺分泌。梨状腺丝是一种干性丝纤维和湿胶的复合体,是构成附着盘的主要组成成分。附着盘能够固定牵引丝使蜘蛛安全、迅速地移动,并将蜘蛛网牢固地附着在各种物体表面上。蜘蛛丝是一种具有生物相容性和可降解性的蛋白类材料。由于绝大多数蜘蛛无法被大规模养殖,因此须通过基因工程手段大量生产蛛丝蛋白,并利用仿生技术制备人工蛛丝纤维。在许多工业领域中,具备出色的机械性能、良好的生物相容性、质地轻柔的纤维更被人们所青睐。人工蛛丝纤维的优良品质将在不同领域发挥作用,如组织工程、军工以及航空航天领域等。目前人造蛛丝纤维产量低、价格昂贵,且材料学性能仍不及天然蛛丝,其原因主要是在蛛丝蛋白仿生的过程中,还存在多个亟待解决的关键性问题:多数编码蛛丝蛋白的全长基因尚未获取,蛛丝基因结构和功能研究较少,成丝机理的阐述仍不清晰等。天然蛛丝的纺丝过程十分复杂精密,在这个过程中,蛛丝蛋白从高度可溶性的储存状态组装成有序的、不溶性的纤维。事实上,纺丝过程中赋予蛛丝蛋白有序的排列是蛛丝高性能的基础,然而,促进驱动蛛丝纤维组装的因素以及蛛丝蛋白对这些因素做出反应的机制还知之甚少。这些都限制了蛛丝蛋白的仿生研究的发展。本论文的内容包括以下四个方面:一、大腹园蛛梨状腺丝蛋白PySp1全长基因的克隆鉴定。首次对于蛛丝蛋白全长编码基因序列的报道是黑寡妇蜘蛛(Latrodectushesperus)的MaSp1和MaSp2。之后其他类型的蛛丝蛋白的基因序列也被鉴定,如大腹园蛛(Araneusventricosus)的MiSp以及LatrodectushesperusAcSp1等。但是,由于蜘蛛蛋白基因具有大量序列重复,再加上基于mRNA的克隆技术存在3′端的偏向性,还有大量的蛛丝蛋白基因的全长序列未被获取。作为一种丝胶混合型蛛丝蛋白,已知关于PySp1的信息十分稀少,只有一个来自Argiopeargentata的梨状腺丝基因被鉴定出来。为了更好地了解PySp1分子结构的多样性以及PySp1与其他蛛丝蛋白家族成员的进化关系,本章通过简并PCR和长距离PCR(LD-PCR)获得了大腹园蛛蛛丝蛋白PySp1的全长序列。PySp1_(A.v)基因全长11931bp,编码蛋白有3976个氨基酸,中心重复区由16个高度同源的单位组成。与以前报道的A.argentataPySp1序列相似,A.ventricosus的PySp1也具有长的含重复序列的N-linker,用来连接N端和重复区域。A.ventricosusPySp1的二级结构和疏水性的预测显示,其末端与重复区主要为α-螺旋结构而N-linker为无规卷曲而且表现出极强的亲水性。系统发育分析结果显示,A.ventricosusPySp1与其他物种的PySp1基因被分组在一个独立的进化分支上,与其他类型的蛛丝基因共同组成了一个庞大的蛛丝基因家族。二、大腹园蛛新型梨状腺丝蛋白PySp2全长基因的克隆鉴定及纺丝研究。随着基因组测序的发展,在同种蜘蛛中甚至发现了多达数十种MaSp蛋白基因,但目前只有一种类型的PySp基因即PySp1被报道。为了扩展对蛛丝蛋白基因家族的知识,发现和研究新的蛛丝基因是必要的。本章通过RACE和LD-PCR鉴定得到第二种类型的大腹园蛛的梨状腺丝蛋白(PySp2_(A.v))基因序列。与PySp1_(A.v)的重复序列相比,PySp2_(A.v)的重复序列更为复杂可分为4种不同类型的重复区其中包含3种和其他梨状腺丝蛋白完全不同的重复序列模块,以及一种与PySp1_(A.v)的重复单元具有较高相似度的重复序列。PySp2_(A.v)linker比PySp1_(A.v)linker短且序列也简单。系统发育分析结果显示,PySp2_(A.v)与PySp1_(A.v)基因在一个独立的进化分支上,但被分在不同的亚分支上,彼此遗传距离相对较远。而且,本章还构建了含有部分PySp2_(A.v)重复区片段的重组蛋白PySp2-R1B并在大肠杆菌中表达,初步研究了PySp2_(A.v)蛋白的原核表达及成丝机理。结果表明,在16℃下LB培养基诱导表达16h获得了较高的蛋白质表达量。通过湿纺和手工拉丝的方法分别制备了丝纤维,虽然PySp2-R1B只含有部分重复单元,但依然可以自组装形成丝纤维。全长PySp2_(A.v)基因序列为人工蛛丝纤维提供新的模板,PySp2-R1B纺丝为大量生产仿生蛛丝奠定了理论和技术基础,而且也证实了多个梨状腺丝蛋白基因的存在。三、大腹园蛛MaSp1可变剪接体基因的克隆鉴定、基因结构、表达和成丝机理研究,两个可变剪接体的性质揭示了N-linker的独特功能。真核生物中广泛存在可变剪接。然而,在圆网蜘蛛Nephilaclavipes中只发现了两个MaSp的可变剪接体。蛛丝蛋白主要由三个结构域组成,一个巨大的中央重复区以及侧翼的非重复且相对保守的N和C末端结构域。末端区域被认为是负责丝纤维形成过程中的自组装,而重复区则决定了丝纤维的的机械性能。然而,作为用于桥接末端与重复区域的结构,linker的功能至今仍不清楚。为了更好地了解linker功能并深入对蛛丝蛋白可变剪接事件的了解。在本章中,我们通过逆转录PCR从A.ventricosus获得了两个MaSp1剪接体。这两个MaSp1剪接体的一级结构表明,两者都几乎没有重复区,并且只有NT和CT。两种可变剪接体之间的主要区别是是否包含N-linker结构。因此,两种可变剪接体的不同性质可以反映N-linker的功能。对两个可变剪接体蛋白的疏水性以及二级结构预测表明,N-linker主要为无规卷曲结构且表现出极强的亲水性。此外,两个可变剪接体以及N-linker重组蛋白在大肠杆菌中进行表达,之后通过手工牵拉将其纺成丝纤维。Western印迹结构表明,含有N-linker的蛋白更可能在溶液中形成二聚体。在不同温度下的CD结构显示,N-linker可以有效地提高丝蛋白的热稳定性。机械性能结果显示,较大的可变剪接体蛋白的丝纤维的机械强度也得到显著提高,表明N-linker可能促进分子间二硫键的形成,从而增加了自组装丝纤维的断裂强度。本研究不仅首次证实了MaSp1的N-linker在蛛丝蛋白的聚集和形成过程中的重要作用,填补了N-linker功能研究的空白,而且还证明了缺少重复区的蛛丝蛋白仍然可以自我组装成高强度的丝纤维。该研究扩展了构建最佳重组蛛丝蛋白序列的设计思路,为高性能人造纤维奠定了良好基础。四、大腹园蛛PySp-MiSp融合转录本鉴定和基因组密码子研究。本章通过转录组测序比对首次发现了天然蛛丝蛋白融合转录本的存在,为制备高机械性能的人工嵌合蛛丝纤维提供理论依据。为了解大腹园蛛密码子使用的特性,以大腹园蛛基因组数据为材料,首次对大腹园蛛的密码子的使用及影响因素进行了分析,评价了自然选择作用及突变压力在塑造大腹园蛛基因密码子使用模式中所起的作用。从大腹园蛛基因组数据中筛选184982个高置信CDS序列,经过一系列的分析,发现大腹园蛛的密码子使用偏好较弱;受核苷酸组成,突变压力,自然选择,基因长度及基因表达水平的综合影响,但突变压力可能对密码子偏性起主要作用;计算得到19个最优密码子,其密码子的第3位都是A或T;大腹园蛛密码子和五种模式生物相比较结果表明其与烟草(Nicotianatabacum)和家蚕(BombyxMori)密码子差异最小。此外,根据密码子使用情况对蛛丝蛋白基因进行聚类分析,基因间以蛛丝蛋白类型进行分组。首次利用生物信息学方法分析大腹园蛛编码蛋白基因的密码子偏好性,确定高频密码子和最优密码子,对蜘蛛的进化、新基因发现提供了必要的参考。