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心脏是胚胎发育过程中第一个开始发育的器官,心脏在胚胎期的发育异常会导致先天性心脏病的发生,而先心病在人类中是最常见的先天畸形,其发病率可达1%至5%。先心病不光在心血管系统危害人类的健康,先心病也是引起其他系统的疾病的重要因素,包括心律失常、猝死、肺功能障碍等疾病。了解并探索心脏胚胎发育中的分子与遗传机制可以为更好的预防和治疗先心病提供重要的线索。对临床和基础科研都有重要意义。线粒体是真核细胞中的非常重要的细胞器,起源于20亿年前。线粒体为双层脂膜结构,其内膜折叠成嵴,目的在于扩大内膜表面积。外膜则是线粒体与细胞基质的分界,其上有多种受体,可以与其它细胞器进行交流。在内膜上有氧化磷酸（OXPHOS）复合体I到V,其主要功能是参与ATP的产生。线粒体渗透性转变孔（mPTP）位于线粒体膜上,其准确定位目前还未可知。内外膜之间是膜间隙,其中包含了细胞色素C,它在氧化磷酸复合体中起传递电子的作用,此外它也可以促使细胞凋亡的发生。内膜内是线粒体基质,其中有线粒体DNA,核糖体,酶以及各种离子。线粒体的融合与裂变的动态循环可以保证其在不同细胞中的形态,分布和大小,这一过程称为“线粒体动力学”。线粒体在心脏发育过程中起到了非常关键的作用,现发现在心脏发育过程中,线粒体生物发生,活性氧（ROS）,细胞凋亡,线粒体融合与分裂等均在小鼠心脏发育中起关键作用。Dynamin-related protein 1（Drp1）是蛋白质发动蛋白超家族的成员,由GTP酶和GTP酶效应结构域组成,它们通过螺旋状氨基酸区段相互分离。Drp1作用于线粒体外膜诱导线粒体分裂。此前有研究表明同属GTP酶的dynamin-2也可作用于线粒体的分裂,可最近研究表明,只有Drp1对于线粒体的分裂有重大意义,而Dynamin1-3在线粒体分裂中是可有可无的。而Drp1在小鼠心脏发育中的作用已经有相关研究,先前研究使用Cre-Loxp系统在小鼠心脏心肌细胞中条件性敲除Drp1,先前的研究的主要是在出生后新生鼠中使用Mhy-6-Cre-Drp1loxp/loxp与Mck-Cre-Drp1loxp/loxp在心肌细胞中敲除Drp1,研究发现敲除Drp1会导致新生鼠死亡,基因缺陷鼠出现扩张性心肌病,心脏形态改变,心肌细胞形态改变,线粒体正常功能丧失。而Drp1在胚胎时期心脏心肌细胞发育中的作用依然不清楚。在我们目前的研究中,我们主要探讨在小鼠胚胎时期在心肌细胞中条件性敲除Drp1对于小鼠胚胎期心脏发育的影响。方法:1.探讨胚胎时期在心肌细胞中条件性敲除Drp1对于心脏形态发育的影响;用Mef2C-Cre;Drp1loxp/+雄性小鼠与Drp1loxp/loxp雌性小鼠杂交以获得实验组（突变型）(Mef2C-Cre;Drp1loxp/loxp)以及对照组（野生型）(Drp1loxp/+)小鼠。将E9.5和E10.5的实验组胚胎及其同窝对照组胚胎进行矢状切片,之后进行免疫荧光染色以检测Drp1在胚胎心脏中的表达情况。将E11.5至E16.5对照组和实验组的心脏切片并做HE染色。2.探讨胚胎时期在心肌细胞中条件性敲除Drp1对于心肌细胞增殖、凋亡以及在心室壁中取向的影响;将E12.5的对照组与实验组的心脏切片,并利用免疫荧光染色检测心脏心肌细胞中的细胞增殖、细胞凋亡以及心室壁上的心肌细胞的取向。3.探讨对照组与实验组心肌细胞在心室壁中取向不同的原因;将E12.5的对照组和实验组心脏冰冻切片,利用免疫荧光染色检测不同基因型心肌细胞表面N-钙粘蛋白的表达;采用Western blot技术对从心脏中提取出的蛋白中N-Cadherin蛋白的表达进行检测。4.探讨条件性敲除Drp1后心肌细胞中线粒体在细胞中分布以及形态的改变;将E10.5的对照组和实验组胚胎做石蜡切片,使用免疫荧光染色心肌细胞中的线粒体在心肌细胞中的分布情况;将E14.5的对照组和实验组心脏心肌细胞进行体外细胞培养,使用免疫荧光染色技术对心肌细胞进行染色,观察对照组与实验组心肌细胞中线粒体在细胞中的分布情况;将E11.5与E14.5的对照组和实验组心脏做成电镜切片,使用电子显微镜技术观察野生型与实验组心肌细胞中线粒体的超微结构的改变。5.探讨条件性敲除Drp1后心肌细胞中线粒体内膜上氧化磷酸化复合体功能的改变;将E14.5的对照组和实验组心脏做新鲜组织冰冻切片,采用DAB染色与NADH染色技术,检测对照组与实验组心肌细胞中线粒体中的氧化磷酸化复合体I和复合体IV的功能;将E14.5的对照组与实验组小鼠心脏取出,采用检测心肌组织在不同时期氧气消耗以及呼吸速率的方法对线粒体内膜上的呼吸链电子传递以及ATP的产生的功能进行检测。6.探讨条件性敲除Drp1后对照组与实验组心肌细胞的RNA表达谱的差别;从E13.0的对照组与实验组心脏中提取心肌细胞,经过细胞分选,采用单细胞RNA测序技术,检测这个时期各个不同细胞群中基因的表达,通过对RNA测序的分析,检测对照组与实验组心肌细胞因缺失Drp1所引起心肌细胞中相关的RNA表达的改变。结果:1.免疫荧光分析显示Drp1在E9.5实验组胚胎心脏右心室和流出道中部分被灭活,而在E10.5实验组胚胎心脏右心室和流出道中全部被灭活;从E12.5开始,实验组心脏形态开始发生改变,实验组心脏右心室发育开始减缓,右心室体积较野生型心脏右心室小,直至E17.5,所有实验组胚胎死亡。2.E12.5时,免疫荧光分析显示实验组心脏右心室心肌细胞增殖较对照组明显降低,而实验组心脏右心室心肌细胞凋亡较对照组明显增加,实验组心脏右心室室壁心肌细胞取向同对照组心脏右心室室壁心肌细胞取向不同。3.免疫荧光分析显示,E12.5时实验组心脏右心室心肌细胞表面N-钙粘蛋白表达较对照组右心室心肌细胞明显下降;Western blot显示,实验组心脏蛋白中的N-钙粘蛋白表达较对照组下降。4.免疫荧光分析显示,E10.5时实验组心脏右心室心肌细胞中线粒体的分布同对照组不同;E14.5时,体外心肌细胞染色显示实验组的细胞周围线粒体分布同对照组细胞周围线粒体分布不同,实验组细胞出现过度融合征象;电子显微镜显示,E11.5和E14.5时,实验组和对照组心脏中心肌细胞的线粒体超微结构之间差异明显。5.E14.5时实验组心脏中氧化磷酸化复合体I和复合体IV的功能相对于对照组心脏降低;实验组心脏的线粒体的呼吸链电子传递同ATP的产生耦合度较对照组心脏降低。6.E13.0时实验组和对照组心肌细胞测序发现实验组和对照组中共有240个基因的表达改变,根据基因表达,共有35条通路改变,参与细胞内核糖体构建的多个基因表达异常。结论:在小鼠胚胎心脏心肌细胞发育的早期过程中,Drp1起到了至关重要的作用。早期条件性敲除Drp1会引起胚胎致死性,小鼠胚胎发育中心脏形态、结构及功能的异常。实验组心脏中心肌细胞的增殖减低,细胞凋亡增加。在发育过程中心肌细胞的取向异常,而该取向异常通过N-Cadherin蛋白途径控制。实验组心肌细胞中线粒体的分布、超微结构及功能异常,E10.5时心肌细胞中线粒体的分布发生改变,E14.5时可见线粒体过度融合。在电镜下,实验组在E11.5和E14.5时发现线粒体的超微结构发生改变。通过对心肌细胞中线粒体功能的测试,发现实验组心肌细胞的线粒体呼吸功能相对于对照组下降。通过单细胞RNA测序,E13.0时实验组和对照组心肌细胞中大量基因的表达不同,从而导致了许多蛋白表达通路不同,其中参与核糖体构成的多个基因表达异常,我们首次在小鼠胚胎心脏发育中发现线粒体裂变异常可能对编码核糖体蛋白的基因的转录产生强烈影响,表明线粒体动力学与蛋白翻译之间存在串扰。