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目的:从全人源抗鼻咽癌噬菌体单链抗体库中大规模筛选特异性抗鼻咽癌噬菌体单链抗体(ScFv),鉴定其特异性;构建、表达抗鼻咽癌scFv与EGFP融合蛋白,体外、体内实验研究抗鼻咽癌scFv的靶向特异性,为鼻咽癌的发病机制的研究和临床诊断以及导向治疗奠定基础。方法:用鼻咽癌细胞系CNE2和鼻咽细胞系NP69以及人成纤维细胞HUVEC对初级抗体库进行正负淘洗富集以及ELISA筛选,选择与鼻咽癌细胞反应强阳性而与HUVEC以及正常鼻咽细胞反应弱阳性或者阴性的克隆进行免疫组化鉴定并测序。构建特异性阳性克隆HNSA033基因与EGFP融合基因的原核表达载体EGFP-HNSA033/pET-25b(+)并转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,变性条件下纯化融合蛋白EGFP-HNSA033,复性后与CNE2细胞经体外孵育在荧光显微镜下观察抗体HNSA033与鼻咽癌细胞的结合作用。通过尾静脉将复性抗体HNSA033注射入荷鼻咽癌裸鼠体内观察融合蛋白EGFP-HNSA033的体内靶向作用。结果:用细胞对噬菌体抗体库进行三轮正负淘洗和富集后,从中随机挑取4212个克隆进行ELISA筛选,得到1769个与CNE2呈阳性反应的克隆,阳性率为42.0%。其中有3个克隆与CNE2呈强阳性反应,而与NP69、HUVEC等人正常细胞系呈弱阳性或阴性反应。根据相对亲和力指数,选择克隆HNSA033进行免疫细胞化学和免疫组织化学染色,免疫细胞化学结果与ELISA一致;免疫组织化学结果显示HNSA033与鼻咽癌组织和正常鼻咽组织阳性率分别为75.0%和13.3%,差别具有统计学意义(P＜0.05)。成功构建的重组表达载体EGFP-HNSA033/pET-25b(+)经IPTG诱导表达后SDS-PAGE显示融合蛋白EGFP-HNSA033分子量大小为63KD,表达形式分析显示融合蛋白主要以包涵体的形式存在,用His-tag磁珠纯化试剂盒纯化EGFP-HNSA033,复性后与CNE2细胞孵育,在荧光显微镜下观察可见细胞膜上有明显的绿色荧光聚积。体内实验结果显示,尾静脉注射EGFP-HNSA033的荷鼻咽癌小鼠的肿瘤部位有绿色荧光发出,而对照组小鼠的肿瘤部位未见荧光,显示融合蛋白EGFP-HNSA033具有良好的靶向性。结论:通过淘选富集、ELISA筛选从噬菌体单链抗体库中获得3个较好抗鼻咽癌scFv阳性克隆,免疫细胞化学和免疫组织化学鉴定结果显示阳性克隆HNSA033具有良好的鼻咽癌特异性。用分子生物学方法成功构建了EGFP-HNSA033的原核表达载体,表达并纯化EGFP-HNSA033融合蛋白,体外细胞实验显示融合蛋白EGFP-HNSA033与鼻咽癌细胞具有很好的结合特性,动物实验结果显示融合蛋白EGFP-HNSA033具有良好的肿瘤特异性,能明显的聚积在肿瘤部位,具有良好的靶向性。