脑血管病以其高发病率、死亡率、致残率成为当代人类三大疾病死亡原因之一。脑出血是脑血管病危急重症之一,脑出血后血肿周围组织缺血缺氧,继发性脑水肿,血肿及其分解代谢产物的毒性作用等,使神经元发生病理生理的改变,对其进行深入的研究,可为临床用药提供直接而确切的依据。 中医认为中风病的基本病机为本虚标实,病位在脑。出血性中风乃因“离经之血,瘀于脑府”,瘀血日久,生痰水,痰水互结,蕴而生热,致使清窍蒙塞,脑脉不通,气机不畅,元神被困,神机失用,五脏失统,六腑气闭,肢体失用,重则气血阴阳不能互用而离绝脱散。中药复方救脑宁注射液具有化瘀解毒、清热涤痰功效。本课题在中医基础理论指导下,通过在体和体外细胞培养实验,研究救脑宁注射液的药效及其作用机理。1 救脑宁注射液对实验性家兔脑出血保护作用的相关研究 采用脑内血块埋藏术制作家兔实验性脑血肿模型,设正常对照组、模型组、救脑宁注射液大、中、小剂量组、清开灵组。给药方法均为每日耳缘静脉注射,于笫3d、7d、15d观察各项指标。1.1 救脑宁注射液对实验性家兔脑出血神经功能障碍和脑水肿的影响 结果表明,各剂量治疗组与模型组比较脑组织含水量及脑指数显著减少,具有统计学意义(p<0.05),且中剂量效果最佳。各剂量治疗组家兔神经功能障碍也有不同程度改善,提示救脑宁具有促进脑血肿吸收和抗脑水肿作用。1.2 救脑宁注射液对实验性家兔脑出血的脑组织形态学和凋亡的影响 脑组织切片分别采用HE、尼氏体、Mallory染色,光镜下模型组可见血肿区大量神经细胞坏死、崩解,炎性细胞浸润,呈炎性改变,血肿周围缺血区神经元排列紊乱,神经细胞有部分脱失,残留神经细胞肿胀或固缩,出现胶质细胞反应,模型组尼氏小体着色浅淡、稀少。各剂量治疗组3d、7d,15d的上述形态学改变与模型组相比显著减轻。由此可见救脑宁注射液能够明显改善实验性脑出血模型家兔脑组织病理变化。脑组织石蜡切片采用原位末端标记(TUN-EL)法检测神经细胞凋亡,结果表明模型组TUNEL 染色阳性颗粒显著增多,救脑宁中剂量组15 天凋亡明显减少,提示救脑宁中剂量组能够明显抑制脑出血家兔神经细胞凋亡。2 救脑宁注射液对大鼠皮层原代培养神经细胞“缺血再灌”后损伤的保护作用相关研究 取原代培养的神经细胞,加入无糖Earle’s液置一特制的密封罐中,通入93%N2和7%CO2的混合气体, 并将密封罐密封后置37℃恒温孵箱中孵育适当时间,再换成含葡萄糖的Earle’s液孵育,分别模拟缺血再灌过程。2.1 救脑宁注射液对大鼠皮层原代培养神经细胞“缺血再灌”后细胞代谢率和乳酸脱氢酶的影响 救脑宁注射液分别以0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5μl/ml的终浓度进行干预,分别于缺氧2h,再灌2、4、6h后取出测定细胞上清液中乳酸脱氢酶漏出率和MTT值,从而选<WP=4>-2- 救脑宁注射液对家兔脑血肿及离体培养神经细胞损伤的作用机制研究出合适的时间和最适药物作用浓度。结果显示药物的最适治疗浓度为1.5-2.5μl/ml,最佳作用的时间点为缺血2h、再灌4h。2.2 救脑宁注射液对大鼠皮层原代培养神经细胞“缺血再灌”后形态学和凋亡的影响 实验分为正常组、模型组、救脑宁终浓度1.5μl/m1、2.0μl/m1、2.5μl/m13个治疗组、清开灵组,在缺氧/缺糖2h,复氧复糖4h后,分别用倒置相差显微镜、HE染色、尼氏体染色观察神经细胞形态学变化,结果显示:正常组细胞贴壁良好,分布均匀,结构清晰,胞体呈锥形或多极形,光晕明亮,突触伸长,突触间联系密切,尼氏小体清晰,模型组细胞肿胀变形,光晕减弱或消失,部分浮起,尼氏小体模糊。采用免疫组化染色法检测凋亡调控基因bcl-2、bax 的蛋白表达水平。结果显示:模型组与正常组比较bcl-2 蛋白阳性染色强度显著降低,bax蛋白阳性染色强度显著增高,救脑宁中剂量组与模型组比较bcl-2蛋白阳性染色强度增加,bax 蛋白阳性染色强度下降。提示救脑宁抑制脑出血大鼠神经细胞凋亡的机制与调节bcl-2、bax 基因表达有关。2.3 救脑宁注射液对大鼠皮层原代培养神经细胞“缺血再灌”后线粒体膜电位、pH 值和细胞内Ca2+浓度的影响 应用Indo-1负载细胞,用激光共聚焦显微镜检测神经细胞内Ca2+浓度变化,用流式细胞仪分别检测线粒体膜电位及pH值变化。结果显示:与正常组比较,模型组缺氧/缺糖培养2h和再灌4h胞内Ca2+ 浓度均显著增高,救脑宁治疗组与模型组比较,缺氧/缺糖培养2h和再灌4h胞内Ca2+浓度显著下降。模型组缺氧/缺糖损伤2h、再灌4h神经细胞线粒体膜电位和pH 值均显著下降,救脑宁治疗组与模型组比较线粒体膜电位均显著提高。提示救脑宁对神经细胞内Ca2+浓度升高具有明显抑制作用,并且能维持线粒体膜电位的稳定,其抑制细胞凋亡的作用机理可能与抑制细胞内Ca2+的升高和维持线粒体膜电位水平相关。 本实验结果表明救脑宁注射液对实验性脑血肿及神经细胞的缺血再灌损伤具有保护作用,为救脑宁注射液的临床应用提供了实验依据。