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酪氨酸酶(EC.1.14.18.1)是一种多亚基的含铜氧化还原酶,广泛存在于自然界中,其异常表达可引起各种各样的病变,如老年斑、雀斑、光照损伤、果蔬褐变及与人脑中的神经黑色素形成及神经退行性病变相关的帕金森病等。
砂仁为历代常用中药,是四大南药之一,在治疗胃肠道疾病中应用普遍,现代临床还用于对妇产科疾病、心力衰竭和抗肿瘤等方面的医疗,而其作用于酪氨酸酶的研究鲜有报道。本论文以砂仁为研究对象,经分级萃取得到五相萃取物,测定提取物对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶的抑制作用机理。检测了砂仁提取物对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力及总还原力,同时研究了提取物对细菌的抑制作用。以小鼠B16黑色素瘤细胞为研究对象,研究了提取的效应物对细胞增殖率、酪氨酸酶活性、黑色素含量的影响,并对其活性成分进行分析鉴定。本文研究结果和内容如下:
(1)本文运用超声提取,分级萃取,大孔树脂AB-8及HPLC等分离纯化手段,以酪氨酸酶抑制活性为指标,对砂仁提取物活性成分进行了追踪分离,最终通过比较分析推测有效成分可能含有槲皮苷和异槲皮苷。
(2)对砂仁各提取物进行酪氨酸酶抑制活性实验,结果表明各提取物对酪氨酸酶二酚酶呈现不同程度的抑制作用,部分提取物对单酚酶也有较强抑制活性。同时深入研究探讨了效应物对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制机理和抑制类型,测定了相关抑制常数。
(3)选择了砂仁各提取物作为效应物,研究其清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力,并测定了各效应物的总还原力。进一步验证天然活性物质与酪氨酸酶的结合方式,为确定天然活性物质的作用机理奠定基础。
(4)研究了砂仁提取物对细菌的抑制效果,探讨酪氨酸酶抑制剂与抗菌之间的联系,为进一步揭示酪氨酸酶在细菌生长中的作用提供支持。
(5)研究了砂仁中酪氨酸酶天然抑制剂对小鼠黑色素瘤B16细胞的药效学效果,通过加药后细胞增值率、酪氨酸酶活性和黑色素含量等指标的变化,确定筛选出的天然活性成分的毒性、抑制酶活力效果、抑制黑色素合成能力以及分解黑色素能力等机制,从而为酪氨酸酶抑制剂的应用提供理论支持。