车前科（Plantaginaceae）车前属（genera Plantago）植物共有约265种，广布于全世界，是很多地区居民熟知的历史悠久的疗伤草药。车前子为车前科车前属植物大粒车前Plantago asiatica L．的干燥成熟种子，具有药蔬兼用、医食同源之性，被国家卫生部列为可用于保健食品的物品。本文以江西省吉安产大粒车前子为主要研究对象，在考察车前子有关生物活性的基础上，应用现代分析分离技术和研究方法，重点对其活性成分多糖类、黄酮类和苯乙醇苷类进行了提取分离、含量测定、结构表征和体外活性研究，试图探寻车前子活性成分与其功效之间的关系，为拓展车前子新的食用和医用空间、合理利用车前子奠定坚实的理论基础。现将本文主要研究结果归纳如下：1．首先对溶剂法和超临界流体萃取法提取车前子总黄酮的工艺分别进行了研究。确立了溶剂法最佳工艺条件为：乙醇浓度60％、固液比1：30、提取温度90℃、提取3次、每次2h。车前子总黄酮的提取率可达2.61％。各提取因素对总黄酮提取率的影响程度由大到小依次为：乙醇浓度＞温度＞提取次数＞固液比。乙醇浓度对车前子总黄酮提取率的影响显著（P＜0.05），而温度有一定的影响（0.05＜P＜0.10），固液比和提取次数在选取的水平范围内对总黄酮提取率影响不明显。确立了超临界提取工艺对车前子总黄酮的最佳提取条件为：每克车前子原料中加入2.5mL无水乙醇作为夹带剂，在温度45℃、压力30MPa的条件下提取2次。超临界提取各因素对总黄酮提取率的影响大小顺序依次为：提取次数＞提取压力＞夹带剂用量＞提取温度，提取次数和提取压力对总黄酮提取率具有显著性影响（P＜0.05），夹带剂用量有一定影响（0.05＜P＜0.10），温度在选取的水平中影响不明显。车前子总黄酮的提取率为1.58％，低于溶剂法提取，但杂质含量低。2．其次，建立了车前子中多糖和苯乙醇苷类的含量测定方法。建立了以木糖作标准曲线，采用苯酚-硫酸法进行车前子多糖含量测定的方法。通过对葡萄糖、木糖和车前子多糖分别采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法显色的扫描吸收光谱数据进行分析，发现苯酚-硫酸法更适合测定车前子中多糖的含量，用木糖作标准曲线得出的结果更能准确反映真实的多糖含量值。对苯酚-硫酸法测定车前子中多糖含量的测定条件优化为：2mL样液先加3％苯酚溶液0.5mL，混匀后加浓硫酸4mL，迅速摇匀后，室温放置35min，在480nm处测定其吸光度。平均回收率为98.9％，RSD=1.79％（n=6）。此方法是一种测定车前子多糖含量的理想方法，亦可为其他类多糖测定提供依据。建立了反相高效液相色谱法同时测定车前子中毛蕊花苷和异毛蕊花苷含量的方法。苯乙醇苷类是车前子主要有效成分，但药典中没有记载其含量的测定方法。本文采用反相高效液相色谱法在Waters Symmitry C₁₈（5μm，250mm×4.6mm）色谱柱上以甲醇：体积分数0.1％甲酸溶液（v40：v60）为流动相，流动相流速为0.6mL／min，检测波长为330nm，同时测定车前子中毛蕊花苷和异毛蕊花苷的含量。毛蕊花苷线性范围为0.2～2.0μg，线性回归方程为y=2E+06x+101494，相关系数r=0.9982。异毛蕊花苷线性范围为0.2～2.0μg，线性回归方程为y=2E+06x+8565.1，r=0.9957。样品的平均回收率分别为毛蕊花苷99.7％、异毛蕊花苷101％。测得大粒车前子中毛蕊花苷含量为8.65mg／g，异毛蕊花苷含量为1.36mg／g。该方法快速简捷，无需对样品进行太多柱前处理，精密度高，重现性好，可为该药材及制剂的质量控制提供依据。3．再次，对车前子多糖、黄酮和苯乙醇苷组分的分离纯化和结构鉴定进行了研究。对车前子多糖提取液的纯化和组分分离进行了研究。先确立了车前子多糖提取液中有效脱除游离蛋白的方法。将三氟乙酸法、盐酸法、Sevage法、酶解和Sevage法联用分别应用于脱除车前子多糖提取液中的蛋白，结果表明四种方法对车前子多糖提取液中蛋白的脱除效果相差不大，而酶解和Sevage法联用在保留较高蛋白脱除率的同时，能获得最高的多糖得率，故此法较其他方法更适合于车前子多糖提取液中蛋白质的脱除。然后采用Sephacryl-400葡聚糖凝胶层析柱（25XK×60cm）与大分子纯化系统AKTA Purifier 100联用对车前子精制多糖进行纯化，得到一个主要的多糖组分，经高效凝胶渗透色谱检测发现其色谱峰为单一对称色谱峰，该组分在示差检测器上监视到的多糖吸收峰和紫外检测到的蛋白质特征吸收峰（280nm）的最大值位置基本重叠，表明该组分可能是糖和蛋白的复合物。收集该组分，命名为SPG（Semen Plantaginis Glycoprotein）。以已知分子量的T-10、T-40、T-70标准葡聚糖和蓝色葡聚糖为标准作标准曲线，经HPGPC法测定，其分子量约为1461100道尔顿。建立了液-液萃取富集有效成分和大孔树脂吸附技术纯化车前子乙醇提取液的方法。车前子乙醇提取液经有机溶剂乙醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇依次萃取后，对所得各萃取部分进行体外抗氧化活性检测，发现正丁醇萃取部分的抗氧化活性最高，表明在用乙醚萃除初提液中的脂溶性物质后，可用水饱和正丁醇萃取富集抗氧化有效成分。本文还对非极性树脂D101、弱极性树脂AB-8、极性树脂NKA-2和NKA-9四种树脂纯化总黄酮的效果进行了比较，结果发现AB-8型大孔树脂对车前子总黄酮的吸附率和解吸率均较高，适合用来纯化车前子黄酮，可使总黄酮含量从纯化前的4％提高到30％以上，达到较好的纯化效果。为深入了解纯化后车前子黄酮液的主要化学成分，便于后续单体分离实验的顺利进行，对纯化液进行了液相色谱．质谱联用技术分析，发现其化学成分主要是苯乙醇苷类（毛蕊花苷、异毛蕊花苷和大车前苷）、黄酮类（芹菜素的葡萄糖苷和双糖苷）和环烯醚萜类（京尼平苷酸）。采用AB-8型大孔树脂吸附结合制备液相色谱技术从车前子中分离纯化得到2个黄酮苷类单体和2个苯乙醇苷类单体，经对其UV、IR、ESI-MS和NMR波谱数据进行分析，鉴定为野漆树苷、芹菜素-7-O-葡萄糖苷、毛蕊花苷和异毛蕊花苷。尚未见有关野漆树苷在车前属中被发现、芹菜素-7-O-葡萄糖苷在车前子中被发现的文献报道。研究表明，大孔树脂吸附结合制备液相色谱技术适合于大批量高效地分离植物有效成分。4．最后，对车前子成分的体外活性进行了研究。在本实验室付志红博士发现了车前子水提物有免疫促进作用的实验基础上，研究了车前子精制多糖对环磷酰胺致免疫抑制小鼠免疫功能的影响。研究发现，45℃低温提取和沸水浴提取的车前子多糖SPL和SPB均对免疫抑制小鼠的免疫功能有影响，且影响效果接近；不同浓度的大粒车前子精制多糖可显著提高免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率、促进淋巴细胞转化、促进溶血素抗体分泌、促进脾脏T淋巴细胞分泌IL-2（P＜0.05），使之接近正常小鼠的免疫水平，且低剂量组（0.2％车前子多糖）效果好于高剂量组（0.4％和0.8％车前子多糖）。说明车前子多糖有较强的免疫增强作用，提取温度对车前子多糖活性的影响不大。此外，本文采用对小鼠骨髓来源的树突状细胞的增殖影响实验研究了毛蕊花苷和异毛蕊花苷的免疫活性，结果发现它们具有良好的免疫活性。树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是机体功能最强的专职抗原提呈细胞，毛蕊花苷或异毛蕊花苷单独使用均可明显刺激BM-DCs增殖，有类细胞因子作用；与细胞因子联用时，均可显著增强细胞因子对BM-DCs的增殖作用。但在浓度过高时，会有一定的细胞毒性作用。毛蕊花苷和异毛蕊花苷能促进树突状细胞的增殖，增强树突状细胞的活力和生命力，可能是车前子具有免疫调节活性的另一作用机理。通过体外抗氧化功能实验发现，车前子乙醇提取物具有较强的清除DPPH自由基活性和抑制邻苯三酚自氧化能力，活性与样品使用浓度呈明显的量效关系。从车前子乙醇提取物中分离得到的单体毛蕊花苷、异毛蕊花苷、野漆树苷具有很强的体外超氧阴离子自由基清除能力、羟自由基清除能力和卵黄脂蛋白脂质过氧化抑制能力。研究表明这三种物质具有优良的抗氧化特性，对车前子的抗衰老、抗炎症等功效起着重要作用。