肺癌是恶性程度最高的癌症之一，其中非小细胞肺癌占所有病例的75-80%。尽管肺癌的诊断和治疗策略不断涌现，其五年生存率仍只有8–14%。肺癌的早期转移特性以及临床缺乏遏制肺癌转移的有效策略，是造成肺癌生存率偏低的主要原因。因此，对非小细胞肺癌转移机制的研究将有利于肺癌的早期诊断和治疗，提高癌症病人的生存率以及生存质量。肿瘤细胞的迁移是癌症侵袭和转移的必要步骤。据报道，广泛存在的第二信使钙离子在细胞迁移中发挥重要作用，但由于其作用机制复杂，迄今对其在细胞迁移中的作用和机制并不完全清楚。细胞的迁移依赖细胞外钙离子的内流，因此，细胞膜参与钙离子内流的离子通道将成为研究的重点。TRP通道是非选择性阳离子通道，在各种兴奋性以及非兴奋性细胞参与钙离子的内流。近期研究显示TRP通道参与肿瘤细胞迁移。TRP通道包括TRPC, TRPM, TRPV等7个亚家族。很多TRP通道被发现在癌症细胞高表达。在肺腺癌A549细胞TRPC1、TRPC3、TRPC6、 TRPC7和TRPM7等TRP通道的基因表达已有文献报道，其中，TRPM7的表达最高。TRPM7是一个广泛存在的对多种一价和二价阳离子有通透作用的具有通道和激酶双重作用的TRP通道。最近研究显示，TRPM7参与PDGF引起的人成骨细胞以及胚胎肺成纤维细胞的增殖和迁移，也参与鼻咽癌细胞5-8F的迁移。根据以上研究成果，我们提出假设：TRPM7可能在肺腺癌细胞的迁移中发挥重要作用。EGFR在很多癌症细胞中表达增加，并被认为在肿瘤的侵袭和迁移中发挥重要作用。EGFR的阻断剂如Iressa和Erbitux等被广泛用于癌症，特别是肺癌的治疗，并取得较好的治疗效果。TRPM7是否为EGFR的靶点参与肿瘤的侵袭和迁移？迄今为止尚无相关研究。本研究采用电生理、分子生物学和免疫荧光技术证实了TRPM7在A549细胞的功能性表达，并提示TRPM7可能作为EGF调节的下游信号分子参与肿瘤细胞的迁移。我们的研究将进一步完善肿瘤细胞迁移的机制，为临床肺腺癌的治疗提供新的靶点。第一部分TRPM7在肺腺癌细胞的功能性表达目的：（1）研究TRPM7在肺腺癌细胞和组织中的表达及生物物理学、药理学特征。方法：本研究采用RT-PCR、Western blot、免疫组化、免疫细胞化学和激光扫描共聚焦显微镜技术验证TRPM7在A549细胞和肺腺癌组织的mRNA和蛋白表达。利用全细胞膜片钳技术检测A549细胞电流特性。全细胞电流记录采用-120mV到+120mV的ramp电压刺激程序。利用TRPM7的阻断剂2-APB和针对TRPM7的shRNA来鉴定所记录的电流中是否含有TRPM7电流成份。并进一步采用不同浓度钙离子和镁离子的细胞外液研究细胞外二价阳离子对TRPM7电流的调节作用。结果：1A549细胞类TRPM7电流的生物物理学特性我们首先采用全细胞膜片钳技术研究A549细胞的全细胞电流特征。记录采用无Mg2+电极内液，从-120mV到+120mV的电压刺激程序。在细胞外钙离子存在的情况下，记录到的电流表现为具有显著外向整流特性的较大外向电流以及较小的内向电流。外向电流在细胞破膜后，逐渐增加，十分钟达稳定状态。此电流的电流-电压关系与异源表达的TRPM7电流相似。移除细胞外钙离子可诱发强大的具有内向整流特性的内向电流。统计结果显示：当细胞外液含有1mM Ca²⁺时，-100mV电压下内向电流密度为2.45±1.67pA/pF；+100mV电压下，外向电流密度为42.25±14.09pA/pF；+50mV电压下，外向电流密度为7.07±3.14pA/pF。当去除细胞外液的钙离子后，此内源性电流特性发生显著变化：内向电流增大，且表现出明显内向整流特性。-100mV电压下，内向电流密度是23.54±9.06pA/pF，与其在含1mM Ca²⁺细胞外液时电流密度相比增大约9倍；+100mV电压下外向电流的电流幅度变化不大，电流密度是41.38±16.93pA/pF，与其在含1mM Ca²⁺细胞外液时的电流密度几乎相等；+50mV电压下外向电流的电流幅度明显增加，电流密度为18.94±8.46pA/pF，与其在含1mM Ca²⁺的细胞外液时电流密度相比，增加约1.7倍。其外向整流特性消失。上述A549全细胞电流特征与TRPM7电流类似，因此我们称其为类TRPM7电流。这些结果表明，细胞外钙离子浓度的降低，不仅可以增加类TRPM7内向电流幅度，对其外相电流也有增加作用。2TRPM7在A549细胞和肺腺癌组织的mRNA和蛋白表达RT-PCR和Western blot结果显示，TRPM7mRNA和膜蛋白在A549细胞有丰富的表达。而且，我们采用免疫组化的方法在肺腺癌组织也检测到TRPM7的蛋白表达。此结果支持我们所记录的类TRPM7电流的分子基础为TRPM7。22-APB抑制A549细胞内源性类TRPM7电流2-APB是TRPM7通道的非选择性阻断剂。在含1mM Ca2+的细胞外液中，2-APB可以阻断类TRPM7的外向电流。2-APB （200μM）在1mM细胞外钙情况下，能阻断在+100mV电压下所记录的电流的70%。100μM到1mM2-APB对所记录的外向电流的阻断作用呈剂量依赖性，而5mM2-APB对电流的阻断作用减弱。灌流正常细胞外液情况下，+100mV电流密度为43.60±6.21pA/pF，细胞外液添加100μM、200μM、500μM和1mM2-APB时，+100mV电流密度分别为23.10±5.26pA/pF、16.96±3.00pA/pF、7.51±2.90和6.42±2.90pA/pF。2-APB的抑制作用可逆。2-APB也可阻断移除细胞外钙离子诱发的类TRPM7内相电流。200μM2-APB可阻断-100mV电压下内向电流的90%。2-APB对无钙外液中细胞的外向电流也有阻断作用，而且令人感兴趣的是2-APB在阻断无钙外液类TRPM7外向电流的同时，恢复了其外向整流特性。2-APB的阻断作用可逆。4细胞外液二价阳离子对类TRPM7电流的阻断作用为进一步阐明A549细胞类TRPM7电流的特性，我们研究了细胞外二价阳离子对TRPM7电流的调节作用。细胞外1mM Mg²⁺或1mM Ca²⁺可几乎完全阻断类TRPM7内向电流，两者作用没有显著差别。而外向电流对钙离子和镁离子阻断作用的敏感性不同，其中对钙离子的敏感性更弱一些。结果显示，1mM Mg²⁺降低+100mV下外向电流的60%，而1mM Ca²⁺并未显著抑制+100mV电压下的外相电流。然而，需要指出的是，细胞外二价阳离子对无钙外液中A549细胞外向电流的阻断作用具有电压依赖性。无论钙离子还是镁离子，在低于+100mV电压下均可以显著抑制类TRPM7外向电流。增加细胞外钙离子和镁离子浓度对类TRPM7电流的阻断作用也增加。结果显示，与1mM外钙相比，20mM细胞外钙抑制类TRPM7外向电流的作用明显增强，而对内向电流的阻断作用没有区别。在+100mV电压下，在含有1mM外Ca²⁺的细胞外液中，分别加入1mMCa²⁺、20mM Ca²⁺和5mM Mg²⁺时，所记录到的类TRPM7电流密度分别为39.28±6.02pA/pF、15.19±4.41pA/pF和15.56±3.96pA/pF。20mM外Ca²⁺与5mM Mg²⁺对TRPM7电流的阻断作用没有显著差异，都抑制了在1mMCa²⁺外液下所记录到的类TRPM7电流的60%。有兴趣的是，细胞外添加Ca²⁺和Mg²⁺均可以恢复通过移除细胞外钙离子消失的外向整流特性。5TRPM7是A549细胞记录的外向和内向电流的分子基础我们设计了两条针对TRPM7的shRNA。首先对两条shRNA的沉默效率进行了鉴定。无论RT-PCR还是Western blot结果，均显示shRNA1沉默效率相对较高。为提高转染效率和基因沉默效率，我们还将TRPM7-shRNA1包装成慢病毒，进行后续实验。RT-PCR和Western blot结果显示，慢病毒包装的shRNA1对TRPM7mRNA和蛋白表达的抑制效果明显优于阳离子脂质体转染的方法。为鉴定A549细胞类TRPM7电流的分子基础，我们利用基因沉默技术，观察抑制TRPM7蛋白表达后细胞的类TRPM7电流的变化。统计结果显示，转染对照shRNA（NC-shRNA）的A549细胞+100mV电压下类TRPM7外向电流密度为39.84±9.02pA/pF，而转染TRPM7-shRNA1的A549细胞，+100mV电压下，类TRPM7外向电流的电流密度为9.12±4.81pA/pF，两者存在显著差异，说明此外向类TRPM7电流的分子基础为TRPM7。移除细胞外钙后，会引发具有明显内向整流特性的类TRPM7电流。TRPM7基因沉默后，此内向电流明显减小。病毒转染48-72小时后，-100mV电压下，阴性对照组细胞平均电流密度为29.17±8.05pA/pF，基因沉默组细胞平均电流密度为5.77±2.81pA/pF，相比对照组降低了80%。以上结果证实在A549细胞记录的类TRPM7内向和外向电流的分子基础均为TRPM7。结论：（1）在肺腺癌A549细胞有TRPM7的功能性表达。（2）在A549细胞记录到的内、外向电流的分子基础均为TRPM7。（3）细胞外二价阳离子可阻断A549细胞内源性TRPM7电流。而且，此电流对细胞外镁离子的敏感性高于细胞外钙离子。第二部分EGF通过上调TRPM7促进肿瘤细胞的迁移。目的：我们通过观察EGF对A549细胞TRPM7蛋白表达和通道功能的调节作用，以及TRPM7在EGF促肺腺癌细胞迁移中的作用，探讨TRPM7与肿瘤转移的关系。方法：采用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学和激光共聚焦技术研究A549细胞TRPM7的mRNA和蛋白表达。采用全细胞膜片钳技术检测EGF对A549细胞TRPM7电流的作用。TRPM7电流记录采用-120mV到+120mV ramp电压刺激程序。创伤-愈合和transwell实验技术用于肿瘤细胞迁移功能的研究。结果：1EGF增加A549细胞TRPM7的膜蛋白表达和通道功能。100ng/ml EGF孵育细胞48小时，TRPM7电流幅度明显增加。+100mV and+50mV电压下，外向电流的电流密度增加了一倍。EGF受体阻断剂AG1478（10μM）不仅可以取消EGF对TRPM7的上调作用，对基础培养基条件下的TRPM7电流也有抑制作用。在含1mM Ca²⁺的细胞外液，EGF并不能增加TRPM7内向电流。而在无钙细胞外液，与对照细胞相比，EGF增加TRPM7内向电流的电流幅度达一倍。2-APB同样可阻断EGF增加的TRPM7电流，恢复TRPM7外向电流的外向整流特性。TRPM7的mRNA和膜蛋白表达在孵育EGF48小时后均有显著增加，而在孵育24小时内作用不明显。2EGF通过上调TRPM7促进肿瘤细胞的迁移。由于EGF刺激A549细胞达48小时后产生上调TRPM7的作用，所以在细胞迁移实验中凡与EGF刺激相关的实验组细胞均为刺激48小时以后的细胞。创伤-愈合实验结果显示，经过16小时的迁移，与对照组相比，EGF刺激的肺腺癌细胞迁移面积增加了一倍。200μM2-APB、AG1478和genistein （10μM）不仅可以抑制EGF增加的细胞迁移，也可抑制对照组细胞基础胎牛血清引起的迁移作用。为进一步探讨TRPM7在A549细胞迁移中的作用。我们采用了基因沉默技术，利用慢病毒携带TRPM7-shRNA1抑制肿瘤细胞TRPM7的表达。创伤-愈合实验显示，转染TRPM7-shRNA1的A549细胞在含10%胎牛血清的培养基中的迁移与转染NC-shRNA的细胞相比，减少了70%。沉默TRPM7也可以抑制EGF引起的迁移增加。Transwell分析与创伤-愈合结果相似。100ng/ml的EGF与对照组相比，迁移细胞的数量增加了3倍。TRPM7-shRNA1不仅抑制EGF引起的迁移细胞增加，还抑制了完全培养基中血清引起的细胞迁移。结论：（1）EGF增加A549细胞TRPM7的膜蛋白表达水平和通道电流幅度。（2）EGF通过上调TRPM7增加肿瘤细胞的迁移。第三部分TRPM7参与EGF促肺腺癌细胞迁移的分子机制研究目的：基于第二部分得到的结论：TRPM7参与EGF的促肺腺癌细胞迁移的作用。我们试图进一步探讨EGF上调TRPM7以及TRPM7参与EGF引起的肿瘤细胞迁移的分子机制。方法：Western blot技术用于检测Akt和Vimentin的蛋白表达。钙成像技术用于细胞内钙离子浓度的检测。全细胞膜片钳技术用于研究PI3K和Akt阻断剂对TRPM7电流的作用。采用rhodamine和FITC结合的鬼笔环肽标记细胞骨架蛋白F-actin，并采用激光共聚焦技术检测F-actin的表达。结果：1EGF通过PI3K-Akt信号通路上调TRPM7蛋白表达和通道功能。Western blot的结果显示EGF显著增加A549细胞Akt的磷酸化水平。EGF上调TRPM7的作用可能通过Akt信号通路。采用Akt的阻断剂Triciribine与EGF共同孵育细胞，电生理检测电流变化，结果显示Triciribine并未抑制TRPM7电流的增加，但PI3K的阻断剂Wortmanin可显著抑制EGF上调TRPM7电流的作用。2EGF通过F-actin的装配和EMT的产生促进肺腺癌细胞的迁移。我们在前期实验中发现，经过EGF孵育48小时的A549细胞，其细胞形态发生明显变化。表现为：细胞体积明显变小，而且细胞形态由鹅卵石样转变为成纤维细胞的状态，多数细胞呈现与其他细胞分离的单细胞状态。在细胞迁移前沿部位的细胞以上特性更为明显。此结果显示，经EGF处理后，细胞可能发生了上皮-间质细胞转化（EMT）。研究认为，EMT是上皮细胞获得恶性表型重要机制之一。为证实这一猜测，我们采用Western blot技术对EMT的标志性的蛋白Vimentin的蛋白表达进行检测。结果显示，EGF可显著增加A549细胞Vimentin的蛋白表达水平。提示，EMT的产生是EGF促进肿瘤细胞的迁移的重要机制。同时提出假设：EMT的产生也可能是TRPM7参与EGF增强肿瘤细胞迁移作用的机制之一。细胞的运动由肌动蛋白的聚合和解聚驱动。为观察EGF对细胞骨架蛋白的作用，我们采用了结合FITC和rhodamin的鬼笔环肽标记细胞F-actin。共聚焦结果显示：EGF可显著增加F-actin的荧光强度，并改变细胞骨架的形态，从长肌丝变为短肌丝。通过稳定转染TRPM7-shRNA抑制A549细胞的TRPM7表达，使EGF对细胞形态及F-actin表达的作用减弱。提示，TRPM7可能通过影响F-actin的聚合参与EGF促进肿瘤细胞迁移的作用。3TRPM7参与A549细胞的钙内流。本实验利用双波长钙成像技术，采用基因沉默方法抑制TRPM7的表达，研究TRPM7在细胞外高钙引起的A549细胞细胞内钙离子升高中的作用。实验结果显示，转染TRPM7-shRNA1的细胞，细胞外高钙引起的钙内流与对照细胞相比显著降低。这一结果提示，TRPM7参与EGF引起的细胞迁移可能与钙离子的内流有关。结论：（1）EGF可能通过PI3K-Akt信号通路上调TRPM7膜蛋白表达和通道功能。（2）EMT和F-actin的聚合可能是TRPM7参与EGF引起的细胞迁移的机制之一。（3）TRPM7介导的钙内流可能是TRPM7参与细胞迁移的机制之一。