萝卜(Raphanus sativus L.)是一种重要的根菜类蔬菜作物,在我国栽培历史悠久,分布广泛。萝卜不仅营养丰富,而且具有较高的药用食疗价值,深受人们喜爱。细胞质雄性不育是一种不能产生正常功能花粉的母性遗传性状,育性由核基因恢复。萝卜的杂种优势明显,利用雄性不育进行杂交种生产是主要的育种方式,因此培育大量优良CMS(cytoplasmic male sterility,细胞质雄性不育)雄性不育系是广泛、高效利用萝卜杂种优势的前提。萝卜雄性不育胞质已成功转育到芸薹属多种作物如油菜、甘蓝、白菜中,是十字花科植物最受关注的不育胞质之一。然而萝卜胞质鉴定的技术体系和分子标记辅助选择候选保持系的技术体系尚未建立,雄性不育产生的机理至今尚未完全阐明。有鉴于此,本研究从形态、细胞、遗传及分子生物学方面对萝卜CMS胞质不育和恢复基因的特征进行研究,以及从基因差异表达水平入手分析花粉发育的特征和分子调控机制,并对相关差异表达基因进行克隆与特征分析。取得的主要研究结果如下：(1)应用鉴定不同胞质类型的特异引物MSF1/R1, LwnomalF/R, LwNWBF/R, KOSF/R和LwDCGMSF/R对80份萝卜自交系与不育系配制的组合以及20个商业品种进行扩增。根据扩增条带,将萝卜胞质分为Ogura, DBRMF1, DBRMF2, NWB, DCGMS,交叉型以及新胞质7种类型。其中大多数材料(65份)是Ogura类型；8份材料是DBRMF1类型；7份材料是DBRMF2类型；10份材料是NWB类型；5份材料是DCGMS类型；3份材料是交叉型,以及2份材料是新胞质类型。细胞学观察发现不同胞质不育系的败育方式相似,在四分体之前不育系小孢子发育没有发生异常,四分体时期绒毡层细胞膨大液泡化,致使后续的花粉发育各过程受阻,最终不能形成花粉而引起败育。(2)萝卜恢复系NAU-RsWR1的Rs-Rfl基因编码687个氨基酸,包含16个PPR重复序列。应用RT-PCR和qRT-PCR分析了恢复系NAU-RsWR1的不同时期、不同器官中Rs-Rf1基因的表达特征,以及分析了在恢复系NAU-RsWR1、不育系NAU-RsWA1、保持系NAU-RsWB1和F1不同发育时期(减数分裂,四分体,小孢子)的花蕾中Rs-Rf1和orf138基因的互作模式。结果显示Rs-Rf1基因在根、茎、叶、花柄、花蕾中都有表达,不过根中表达量较弱；花期各器官的表达量较蕾期的要高。Rs-Rf1基因在恢复系和F1中随着花蕾的发育,表达量逐渐变大,在恢复系中的表达量要高于Fl,而在不育系和保持系中不表达；orf138基因在不育系和F1中随着花蕾的发育,表达量逐渐变大,在不育系中的表达量要高于F1,但在恢复系和保持系中不表达。分别从5个不同的恢复系和保持系中进行恢复基因的分离克隆和测序分析,应用"DNAStar GeneQuest enzyme-restriction map"软件分析发现限制性内切酶SspI在Rs-Rf1和Rs-rf1基因中酶切位点不同,经SspI酶切与聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测,若有2个酶切位点(产生3个酶切片段,大小分别为1,538、629、363bp),则表明该自交系携有育性恢复基因；如果仅有1个酶切位点(产生2个酶切片段,大小分别为2,167、363bp),表明该自交系是保持系。本研究开发的利用分子标记辅助选择萝卜候选保持系的方法,可以快速准确地选择出优良候选保持系,从而提高萝卜优良CMS雄性不育系的选育进程,为大规模优良不育系快速培育提供有力技术支撑。(3)在获得稳定的萝卜胞质雄性不育系NAU-RsWA1和保持系NAU-RsWB1材料体系的基础上,采用mRNA差异显示聚合酶链式反应技术(DDRT-PCR)研究两个材料花粉发育减数分裂、四分体和小孢子3个时期基因的表达差异,获得了90条阳性差异转录片段(transcript derived fragments, TDFs);其中在保持系NAU-RsWB1花粉发育3个时期表达增强的特异片段有60条,在不育系NAU-RsWA1花粉发育3个时期表达增强的特异片段有30条。将差异片段回收、克隆、测序,在GenBank数据库中进行同源序列比对和功能预测,差异表达的基因涉及细胞壁合成与调控、花粉发育,防卫与胁迫反应、电子传递和能量途径、普通新陈代谢、蛋白质代谢、信号转导、转录调控和转运通道等方面,其中39%的差异表达基因功能未知或无相似序列。对22条在不育系和保持系花蕾中差异表达的片段进行时空表达模式分析,发现大多数差异片段所代表的基因在不育系和保持系的不同器官(雄蕊,花瓣,叶,茎)和花粉发育的不同时期(减数分裂,四分体,小孢子时期)的表达不尽相同。(4)利用DDRT-PCR筛选得到了花粉发育相关的差异片段所代表的基因(PCP,Bnm, TCTP, Rac),利用同源克隆得到这些基因的DNA和cDNA全长,分别命名为RsPCPl, RsPCP2, RsBnm, RsTCTP和RsRac,并对它们的氨基酸序列和表达特征进行研究。利用RT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊,花瓣,叶,茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,结果表明,RsPCPl, RsPCP2, RsTCTP和RsBnm基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,但表达强弱不同,在不育系花蕾发育的3个时期都不表达或表达量很弱；这些基因在保持系的雄蕊和茎中表达,除了RsPCP2基因在不育系的雄蕊中检测到较弱的表达外,其它基因在不育系不同组织中都不表达。RsRac基因在不育系3级花蕾中的表达先降低再升高,在保持系3级花蕾中都不表达；该基因在不育系的雄蕊、花瓣、叶、茎中均表达,在保持系不同组织中都不表达。(5)利用DDRT-PCR分析筛选得到了在保持系3级花蕾中微弱表达但在不育系花蕾中高表达的差异片段。采用同源克隆的方法,得到其cDNA全长,命名为RsBHLH。该基因编码336个氨基酸,具有basic helix-loop-helix (bHLH)结构域；进化分析表明,RsBHLH与AtBHLH060同源性很高,是冗余基因AtBHLHs060/048的直系同源基因。RT-PCR和qRT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊、花瓣、叶、茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,结果显示其在不育系雄蕊、花瓣、叶、茎以及花蕾发育的3个时期都有稳定表达,且在雄蕊中表达量最高。同不育系相比,RsBHLH在保持系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达,但在花蕾发育的3个时期中有较弱的表达。(6)利用DDRT-PCR分析筛选得到了一个在保持系3级花蕾都稳定表达且表达量很高,但在不育系小孢子时期的花蕾中有微弱表达的差异片段。采用同源克隆的方法,得到其cDNA全长,命名为RsCHS。该基因编码392个氨基酸,具有CHS结构域；进化分析表明,RsCHS与油菜CHS氨基酸序列一致性最高,达到95%,其次与拟南芥CHS的一致性达到93%。RT-PCR和qRT-PCR分析其在不育系和保持系的雄蕊,花瓣,叶,茎以及花蕾发育的3个时期的表达情况,发现该基因在保持系雄蕊、花瓣以及花蕾发育的3个时期都有稳定表达。(7)利用DDRT-PCR分析筛选得到两个与细胞壁合成和调控相关的基因RsPMEI和RsPG.采用同源克隆法得到cDNA全长。RT-PCR和qRT-PCR分析表明RsPMEI基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,且表达量都很高；在不育系花蕾发育的减数分裂时期和四分体时期有少量的表达,但在小孢子时期不表达；RsPMEI基因在保持系雄蕊中表达量最大,在叶中次之,花瓣中表达量最弱,茎中不表达,该基因在不育系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达。RsPG基因在保持系花蕾发育的3个时期都表达,并且随着发育时期的推进,表达量呈上升趋势,该基因在不育系花蕾发育的3个时期都不表达；RsPG基因在保持系和不育系雄蕊、花瓣、叶、茎中均不表达。