研究背景与目的：鼻咽癌是中国南部和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，多数患者发现时已进入晚期，有资料显示，Ⅲ～Ⅳ期患者占总数的85％左右。近年来，大量临床研究显示放射治疗联合化学药物治疗能取得更高的治愈率，单纯的化学药物治疗对中晚期鼻咽癌的治疗也取得令人瞩目的效果，尤其是吉西他滨（gemcitabine）等第三代化疗药物的出现更使鼻咽癌的治疗效果大大进步。吉西他滨（2′，2-difluorodeoxycytide）是阿糖胞苷的新一代类似物，属抗代谢类抗癌药物，为脱氧胞苷的衍生物，主要在细胞内通过核苷酸激酶作用，催化成有活性的二磷酸双氧胞苷和三磷酸双氧胞苷，后者抑制DNA多聚酶而阻碍DNA合成，从而抑制肿瘤细胞生长，1996年作为用于胰腺癌治疗的唯一药物被美国FDA批准上市。进一步研究发现吉西他滨对头颈部肿瘤也有良好疗效，特别是对氟尿嘧啶耐药的复发转移的晚期患者，吉西他滨的应用取得了瞩目的效果。然而鼻咽癌的整体治疗效果仍然不尽人意，多数晚期患者仍因化学药物治疗失败而死亡，这很大程度归因于癌细胞产生多药耐药性（multidrug resistance，MDR）。肿瘤多药耐药是指一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后，该肿瘤未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。建立多药耐药细胞系是体外研究多药耐药的基础。长期以来肿瘤工作者们致力于寻找逆转肿瘤细胞耐药的方法，然而效果不能令人满意。目前认为肿瘤的发生、发展和转移离不开肿瘤血管生成，抗血管生成成为肿瘤治疗的新思路。血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在肿瘤血管生成中处于核心地位，是目前已知活性最强、专属性最高的血管生成因子。针对VEGF的人源化单克隆抗体贝伐单抗（bevacizumab）2004年被美国FDA批准用于晚期结直肠癌的一线治疗。VEGF及其受体在多种肿瘤中广泛表达，据报道在鼻咽癌细胞中的阳性率为60％～90％，而且VEGF的表达与鼻咽癌临床特征和不良预后有关。已经有30多个临床试验将贝伐单抗应用于各种实体肿瘤和血液系统肿瘤治疗中，包括鼻咽癌在内的多种肿瘤的Ⅱ、Ⅲ期临床试验结果显示了bevacizumab的良好效果。临床观察到联合VEGF单抗和化疗药所建立的生物化疗模式取得的有效率不仅远优于单用化疗或VEGF单抗，而且超过二者代数和，特别是对一部份复发的／转移的病人，已经无效的化疗药物在使用bevacizumab等分子靶向药物后重新恢复敏感性。似乎bevacizumab的抗肿瘤作用除了抑制肿瘤血管形成以外，还包括增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，而后者很可能是通过逆转肿瘤细胞耐药来实现的。本实验目的在于：1．诱导建立人鼻咽癌gemcitabine耐药细胞系并研究其生物学特性。2．在体外研究bevacizumab对耐药肿瘤细胞的影响，探讨是否有逆转肿瘤细胞耐药的作用。研究方法：1．根据文献报道，用RT-PCR方法对5-8F、C666-1、CNE2等鼻咽癌细胞系进行VEGF及VEGFR-2表达阳性筛选，最终检测到CNE2细胞系表达VEGF及VEGFR-2。人鼻咽癌低分化细胞系CNE2培养于含10％小牛血清高糖DMEM培养基，培养条件为37℃5％CO₂饱和湿度孵箱。含0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的完全消化液消化传代。采用药物大剂量冲击法和浓度梯度递增法建立人鼻咽癌吉西他滨多药耐药细胞亚系CNE2／Gem，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测CNE2和CNE2／Gem对吉西他滨、顺铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱等4种常用抗肿瘤药物的半数抑制浓度(IC₅₀)和耐药系数（resistance index，RI），流式细胞术测定细胞周期及细胞内荧光药物罗丹明的蓄积，测绘细胞生长曲线、计算倍增时间并在光镜下观察细胞形态。2．取对数生长期CNE2细胞接种于96孔板，细胞密度为1×10⁵／ml，每孔100ul（10⁴个）。分1个空白对照组和7个实验组，每组6个复孔，分别加入一定浓度的gemcitabin和bevacizumab，培养72h，按前述MTT法测定各组细胞存活率，进而计算药物杀伤率。对照组6个孔吸光度（OD）值取平均值，各实验组每孔吸光度值与该平均值的比值即为每孔的细胞存活率，1-存活率就是每孔药物的杀伤率。用公式表示：杀伤率=（1—实验组各孔OD值／对照组平均OD值）×100％。采用SPSS10.0软件中One-Way Anova方法分析各实验组药物杀伤率的差别。3．CNE2及CNE2／Gem细胞常规培养于50ml培养瓶，镜下观察细胞呈贴壁生长后，分别加入一定浓度的gemcitabine和bevacizumab，具体：1瓶CNE2和1瓶CNE2／Gem中加入gemcitabin，浓度为20ug／ml；1瓶CNE2／Gem中加入gemcitabin和bevacizumab，浓度分别为20ug／ml和10ug／ml，另外1瓶CNE2和1瓶CNE2／Gem作为对照，均放入37℃5％CO₂饱和湿度孵箱培养24h。收集细胞，AnnexinⅤ和碘化丙锭（PI）双染，流式细胞仪（FCM）检测各瓶细胞的凋亡情况。实验重复3次，采用SPSS10.0软件中One-Way Anova方法分析不同处理方法间细胞凋亡的差异。4．在CNE2／Gem细胞培养液中添加bevacizumab，终浓度为10ug／ml，每4天传代1次，连续传4代，得到细胞CNE2／Gem／Bev。用半定量RT-PCR方法检测MDR1、VEGF、Bcl-2、Bax等基因在CNE2、CNE2／Gem、CNE2／Gem／Bev细胞内的表达，计算相对表达量。研究结果：1．从生长曲线计算出CNE2和CNE2／Gem的倍增时间分别为17.13h和23.13h。吉西他滨对CNE2和CNE2／Gem的IC₅₀分别是2.12ug／ml和37.04ug／ml，RI为17.62，对顺铂（cisplatin，DDP）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）及长春新碱（vincristine，VCR）的RI分别为14.94、6.60及14.17，表明其具有多药耐药的特征。流式细胞测定显示CNE2／Gem内罗丹明的蓄积明显低于CNE2（3.56 vs. 220.35）。CNE2／Gem形态在光镜下变圆，大小不一，胞浆有较多颗粒。CNE2／Gem细胞可以稳定传代，耐药性能稳定。2．细胞杀伤结果显示：单用10ug／ml bevacizumab时，杀伤率与对照组相似，两者差别无统计学意义（P=0.140），而且bevacizumab浓度增加一倍但杀伤率无明显变化，高低浓度组间差别无统计学意义（P=0.531）。无论是20ug／ml或40ug／ml gemcitabine，联合10ug／ml bevacizumab所产生的杀伤率明显高于单用gemcitabine，差异有统计学意义（P=0.026，P=0.001）。同时，对于相同浓度gemcitabine，当bevacizumab浓度由10ug／ml增加到20ug／ml时杀伤率并无明显变化，差异无统计学意义（P=0.591）。3．与对照细胞相比，经20ug／ml gemcitabine或联合10ug／ml bevacizumab处理24h后的CNE2和CNE2／Gem细胞，出现明显PS外化现象，即FITC高染区而PI低染区的早期凋亡细胞增多（23.21％vs.5.2％，8.66％vs. 4.71％，39.46％vs.4.71％），FITC和PI均高染区的晚期凋亡及继发性坏死细胞明显增多（50.48％vs.3.1％，48.21％vs. 2.5，42.68％vs. 2.5％），而FITC和PI均低染区的活细胞明显减少（24.45％vs. 92.26％，40.56％vs. 82.37，15.36％vs.82.37％）。CNE2／Gem细胞的早期凋亡率明显低于CNE2细胞（8.87±1.06％vs.23.50±4.21％，P=0.005）；晚期凋亡率也降低（41.70±9.78％vs. 60.52±9.94％，P=0.036）。对于CNE2／Gem细胞，联合20ug／ml gemcitabine和10ug／ml bevacizumab处理24h所诱导的早期凋亡率比单纯20ug／ml gemcitabine明显增高（39.87±5.85％vs. 8.87±1.06％，P＜0.001）；而晚期凋亡率变化不大（37.64±5.11％vs. 41.70±9.78％，P=0.582）。4．半定量RT-PCR方法检测显示CNE2、CNE2／Gem和CNE2／Gem／Bev中MDR1相对表达量分别为0.623、1.364和1.165，VEGF分别为0.241、1.652和1.547，Bcl-2分别为0.613、0.952和0.135，Bax分别为0.665、0.387和1.751。初步结论：1．成功建立了稳定的人鼻咽癌吉西他滨耐药细胞系CNE2／Gem，多药耐药性能显著。2．Bevacizumab可以显著增加人鼻咽癌吉西他滨耐药细胞系CNE2／Gem对gemcitabine的敏感性。单用bevacizumab杀伤作用不明显，与gemcitabine联合可明显提高gemcitabine的细胞杀伤活性。但增加bevacizumab浓度并不能提高杀伤率。3．在gemcitabine作用下人鼻咽癌吉西他滨耐药细胞系CNE2／Gem与其亲本细胞相比早期凋亡细胞明显减少，联合应用bevacizumab后早期凋亡细胞又明显增多。说明bevacizumab能促进耐药细胞的早期凋亡。4．Bevacizumab对耐药相关基因影响不大，但可以显著影响凋亡相关基因的表达，促进耐药细胞凋亡。对于亲本的CNE2细胞，当用gemcitabine诱导其耐药，再用bevacizumab处理耐药细胞，其MDR1的表达先显著上调，再轻微下调；VEGF基因的表达先显著上调，之后基本不变；Bcl-2基因（凋亡抑制基因）的表达先上调再显著下调；Bax基因（凋亡促进基因）的表达先下调再显著上调。总而言之，VEGF单克隆抗体（bevacizumab）可以通过逆转肿瘤细胞耐药，或者说提高耐药肿瘤细胞的药物敏感性来发挥抗肿瘤作用。