蒙古羊肌肉生长抑制素干扰载体的构建与检测

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肌肉生长抑制素(Myostatin)是骨骼肌生长负调控因子,该基因的沉默或突变会使动物表现出明显的“双肌”现象。蒙古羊作为内蒙古高原特色物种之一,其产肉率低下,一直是困扰大规模养殖的瓶颈。本研究利用已经成熟的RNA干扰技术,构建了特异抑制Myostatin表达的shRNA干扰载体,并成功筛选高效率的片段且建立了稳定的Myostatin基因沉默阳性胎儿成纤维细胞系,为培育Myostatin基因沉默的转基因羊奠定基础。本文主要的研究结果如下:(1)成功克隆蒙古羊肌肉生长抑制素cDNA序列。(2)根据蒙古羊肌肉生长抑制素cDNA序列,利用shRNA在线设计软件设计4对特异性针对蒙古羊MSTN基因oligoDNA,随机合成一段oligoDNA作为对照,5对oligoDNA分别退火并构建pSGU6/GFP/Neo-shRNA (MSTN)干扰载体。酶切测序结果正确。(3)建立蒙古羊MSTN基因沉默细胞系:pSGU6/GFP/Neo-shRNA (MSTN)干扰载体转染蒙古羊胎儿成纤维细胞, G418筛选10~12天得到既有G418抗性并荧光强的单克隆细胞22个;实时荧光定量PCR检测:四个载体对MSTN基因表达都产生抑制作用,其中载体shRNA-632的沉默效率最高达到93%;随机挑选shRNA-632干扰载体筛选得到的4个单克隆细胞进一步分析发现重复性好、沉默效率稳定。
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