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背景近年来我国居民心血管疾病的患病率和死亡率居高不下,急性冠脉综合征因发病急、病情危重而严重影响患者的生存。早期积极的经皮冠状动脉介入治(percutaneous coronary intervention,PCI)已成为急性冠脉综合征的治疗标准和常规,而PCI术后难以忽视的再狭窄问题的发生仍给患者带来痛苦,针对再狭窄问题而几经迭代的支架也不能让人完全满意。进一步开发支架材料和技术革新,进一步探寻抗PCI术后再狭窄的解决方案,是临床与科研共同努力的方向。我团队一直致力于急性冠脉综合征的中西医结合治疗,导师王显结合理论与临床,创新性地提出急性冠脉综合征“络风内动”病机理论,并在“祛风通络”治法的指导下,研发出“络风宁0号方”,由紫杉醇和水蛭素构成,以制备中药单体复合物涂于支架,用于防治PCI术后再狭窄,共奏解毒活血、祛风通络之功效。络风宁0号方已经过实验证实能够抑制平滑肌细胞增殖,抗PCI术后管壁再狭窄的发生。但其细胞分子层面的作用机制仍不明朗,亟待进一步探寻。现代研究表明细胞自噬水平可影响平滑肌细胞的生长,本课题选择经典自噬信号通路AMPK/mTOR为切入点,探索络风宁0号方抗人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)增殖可能的作用机制。目的为探索络风宁0号方抗HCASMC增殖可能的作用机制,聚焦于AMPK/mTOR自噬信号通路,观察对比络风宁0号方抗HCASMC增殖时AMPK/mTOR自噬信号通路关键位点蛋白发生了什么变化,分析该信号通路对络风宁0号方抗HCASMC增殖作用可能产生的影响,讨论络风宁0号方抗HCASMC细胞增殖作用可能的作用机制,为中医药新型载药途径的探索助力,也为中医药深入临床防治急危重症做出贡献。方法1.体外培养HCASMC:从原代HCASMC起进行细胞培养、换液、传代及冻存操作,培养出4-6代生长稳定的HCASMC为实验细胞。2.建立血小板衍生生长因子(PDGF)诱导的HCASMC增殖模型:通过MTT实验分析细胞增殖效果,筛选出合适的PDGF诱导增殖方案。3.摸索络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物对HCASMC生长的无毒性配比浓度范围:取红豆杉的单体成分紫杉醇,和水蛭素的衍生物比伐卢定组成络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物,通过MTT实验筛选细胞活力达90%以上的药物浓度范围;4.确定络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物抗HCASMC增殖的有效性配比浓度:在PDGF促平滑肌细胞增殖的基础上,通过MTT实验,在“紫杉醇-比伐卢定”复合物无毒性配比浓度范围之内,确定其有效抗细胞增殖的浓度配比;5.探究络风宁0号“紫杉醇-比伐卢定”复合物对PDGF诱导HCASMC增殖过程中AMPK/mTOR自噬信号通路的影响:通过Western Blot实验对比自噬信号通路关键位点蛋白的变化,尝试分析络风宁0号“紫杉醇-比伐卢定”复合物抗细胞增殖可能的作用机制。结果1.PDGF诱导HCASMC增殖模型的造模方案:通过MTT实验分析不同浓度PDGF刺激下细胞的增殖率,发现在PDGF浓度达40ng/ml时平滑肌细胞增殖率则达到15%以上,与空白对照组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。选定PDGF浓度为40ng/ml、刺激时间为24h为HCASMC增殖模型的造模方案。2.络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物对HCASMC生长的无毒性配比浓度范围:通过MTT实验分析不同配比“紫杉醇-比伐卢定”复合物对细胞生长的影响,发现细胞在“紫杉醇1umol/L+比伐卢定1～5ug/L”浓度范围内的活力>90%,与空白对照组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05),认定其为HCASMC生长的无毒性范围。3.络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物抗HCASMC增殖的有效性配比浓度:通过MTT实验,在PDGF刺激细胞增殖的条件下,在无毒性浓度范围内,发现当紫杉醇1umol/L+比伐卢定2ug/L时,中药复合物抑制PDGF的增殖的作用最强,与造模组相比差异显著,具有统计学意义(P<0.05),选定其为抗HCASMC增殖的有效性配比浓度。4.络风宁0号“紫杉醇-比伐卢定”复合物对PDGF诱导HCASMC增殖过程中AMPK/mTOR自噬信号通路的影响:通过显微镜观察到加入“紫杉醇-比伐卢定”后,因PDGF刺激而出现的增殖现象受到了一定程度的抑制;Western Blot实验结果显示,对照组、造模组和造模加药组所表达的检测蛋白含量均不相同,组间差异显著,具有统计学意义(P<0.05);从检测蛋白含量变化来看,AMPK、ULK1、LC3B、Beclin 1的变化趋势一致,与对照组相比,造模组蛋白含量下降,造模加药组较造模组蛋白含量升高,但低于对照组;mTOR与上述检测蛋白变化趋势相反,与对照组相比,造模组蛋白含量升高,造模加药组较造模组蛋白含量下降,但高于对照组。说明本实验中造模后AMPK与ULK1被抑制,mTOR功能被促进,自噬水平降低,细胞增殖,而加入络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”后AMPK与ULK1功能被促进,mTOR被抑制,自噬水平升高,抑制细胞增殖。结论1.络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物可有效抑制人冠状动脉平滑肌细胞增殖。2.络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物可能通过AMPK/mTOR自噬信号通路调节细胞自噬水平而起到抗细胞增殖作用。3.络风宁0号方“紫杉醇-比伐卢定”复合物作用于AMPK/mTOR自噬信号通路,上调AMPK与ULK1活性,下调mTOR活性,提高细胞自噬水平,抑制PDGF启动的细胞增殖反应。