论文部分内容阅读
番茄青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia Solanacearum,简称青枯菌）引起一种毁灭性土传病害,防治困难。利用青枯菌无致病力菌株研发植物疫苗,是该病害防治的新途径。本研究进行了番茄无致病力青枯菌的遗传稳定性及其诱导抗病机制研究,为青枯病植物疫苗的开发应用奠定理论基础。研究结果如下:（1）以强致病力菌株和过渡型菌株为参比菌株,比较无致病力菌株连续传代50次后的菌株即F50与F1菌株的遗传稳定性,筛选出2株遗传稳定的菌株FJAT-1458和FJAT-1463。具体结果如下:致病力鉴定结果表明,无致病力菌株连续传代过程中弱化指数（Attenuation index,AI）未发生明显变化,AI介于0.76-0.91之间;强致病力菌株及过渡型菌株的F50的AI值均显著大于F1的AI值。无致病力菌株的F50和F1接种番茄植株均未引起植株发病;强致病力菌株连续传代后致病力丧失,其F50接种番茄植株也未引起植株发病;过渡型菌株的F50致病力降低,接种番茄植株21d的发病率比F1降低了 4.17%-23.40%。无致病力菌株传代培养后的F50除FJAT-454和FJAT-15252外,其余菌株的F50和F1的峰型和峰面积无显著差异;强致病力菌株的F50经色谱分离出现P1和P2峰,F1只有P3峰。毒力因子检测结果表明,无致病力菌株（FJAT-454和FJAT-15252除外）的Fso和Fi的胞外多糖（Exopolysaccharides,EPS）含量差异不显著;过渡型菌株和强致病力菌株的F50的EPS含量显著低于F1。无致病力菌株除FJAT-1452的F50比F1多出一条约20kDa蛋白条带外,其余菌株的F50和F1蛋白条带相同。内切-1,4-β-葡聚糖酶（endo-1,4-β-glucanohydrolase,Egl）活性测定结果表明,无致病力菌株除了FJAT-1452和FJAT-15252外,其余菌株F50和F1的Egl酶活性差异不显著,而强致病力菌株的F50的Egl酶活显著低于F1,其中FJAT-15304 F50菌株的Egl酶活为1.30 U/mL比F1（2.97 U/mL）降低了 56.23%。运动能力检测表明,无致病力菌株除FJAT-15249和FJAT-15252外,其余菌株的F50和F1的泳动能力和蜂拥能力均无显著性变化,而过渡型菌株和强致病力菌株的F50和F1的泳动能力和蜂拥能力则差异显著。防效和定殖试验表明,无致病力菌株除FJAT-15249（F1和F50菌株的防效分别为65.28%和59.72%）外,其余菌株的F1和F50菌株防效均无显著性差异。无致病力菌株FJAT-454、FJAT-1458和FJAT-1463的F50和F1菌株在番茄植株及根际土中的定殖能力几乎无显著性差异,但其余的无致病力菌株、过渡型菌株和强致病力菌株的F50和F1菌株在定殖量和/或定殖达到峰值的时间均存在显著性差异。生理生化测定中,API 20E鉴定结果表明,无致病力、过渡型和强致病力菌株均只在ADH、TDA测定项目显示阳性或弱阳性反应,在CIT中F50菌株为阳性反应,而F1菌株为阴性反应,其余测定项目均为阴性反应;API ZYM鉴定结果表明,不同致病力及传代数的菌株在酯酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶和白氨酸芳胺酶反应均为阳性或弱阳性反应,其余测定项目均为阴性反应。（2）以强致病力菌株FJAT-91和清水为对照,利用RT-PCR和RNA-Seq方法研究无致病力菌株FJAT-1458诱导的番茄抗病机制。具体结果如下:诱导抗性基因表达的研究结果表明,不同致病力的青枯菌能在不同程度上诱导番茄抗性基因表达,无致病力菌株诱导番茄抗病反应最强的时间为接种菌株后12 h左右。接种菌株72 h内,无致病力菌株在信号途径（水杨酸、茉莉酸、乙烯）中诱导番茄抗性基因的最大表达量均显著低于强致病力菌株。此外,无致病力菌株对番茄JA信号途径的诱导能力最强,pin2基因的相对表达量为CK的1511.62 倍。诱导番茄抗性的转录组研究结果表明,接种无致病力菌株FJAT-1458后3 d和8 d分别诱导番茄植株次生代谢物上调和下调。对差异表达基因进行功能注释,共获得161529条unigenes的注释结果。GO分类表明,在细胞组分（CC）中细胞（Cell）、细胞器（organelle）和细胞区域（Cell part）是差异基因富集最多的种类;在分子功能（MF）类中,催化活性（catalytic activity）和蛋白结合（binding）是差异基因富集最多的种类;在生物学过程（biological process）中,代谢过程（metabolic process）和细胞过程（cellular process）是差异基因富集最多的种类。KOG分类表明,差异基因富集最多的为一般功能预测（general functional prediction only,15500）。主成分分析表明,CK处理与无致病力菌株处理聚在同一类群中,强致病力菌株处理聚在另两个类群中,说明对照和无致病力菌株诱导番茄转录组相似,与强致病力菌株处理诱导的番茄转录组差异较大。通过以上研究,我们获得了两株遗传稳定的无致病力菌株FJAT-1458和FJAT-1463,初步明确了无致病力菌株FJAT-1458对番茄的诱导抗病机制,为后续植物疫苗的研发和应用提供了原材料和数据支持。