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海带(Laminaria japonica)是我国海水养殖业中重要的经济海藻,其养殖产量居世界首位。海带不仅具有较高的营养价值,而且对近海海洋环境的保护与海水养殖的可持续发展起着重要的作用。海带生活史中存在大型孢子体和微型配子体的世代交替。雌、雄配子体存在明显的差异,对控制这一现象的分子机理目前尚不清楚。为此,对海带雄配子体消减文库中的差异表达基因做深入研究。
随机挑选96个克隆进行PCR扩增,89个克隆具有插入片段。通过核苷酸序列并进行Blastn搜索分析,发现D02克隆与GenBank中糖海带(L.saccharina)lhcf6(褐藻素光捕获蛋白复合物)相似性为91%;A11克隆与巨藻(Macrocystis pyrifra)的fcpf(褐藻素-叶绿素a/c结合蛋白)具有88%的相似性。根据糖海带lhcf6的编码序列设计引物,以海带基因组DNA为模板进行PCR扩增。最终获得海带lhcf6的全长cDNA(GenBank登录号:DQ250739),共1131 bp。其开放阅读框(ORF)与糖海带lhcf6的编码序列具高达99%的相似性,二者非翻译区(UTRs)的相似性仅为94%。海带lhcf6的ORF编码一个含218个氨基酸的前体蛋白Lhcf6,推测分子量为23.1 kD,等电点为5.37,其前40个氨基酸为信号肽;而成熟蛋白含有178个氨基酸,推测分子量为19.3 kD,等电点为4.88。Lhcf6蛋白的高级结构预测结果表明Lhcf6可能包含6个α螺旋和两个β折叠,其中三个α螺旋可能构成类囊体膜跨膜区。通过3-RACE技术获得fcpf3-末端完整cDNA序列,将其和克隆BA079-1及A11的插入片段序列拼接获得601bp的fcpf部分cDNA。
fcpf与lhcf6同属海带捕光蛋白基因家族。根据lhcf6和fcpf cDNA序列设计引物,利用荧光定量实时PCR技术,分别研究lhcf6和fcpf两基因在海带配子产生过程中的时空表达特性。发现了lhcf6、fcpf在海带配子体发育生长过程中,雄配子体中的表达量均较同期雌配子体中高;同时,它们在雄配子体中存在优先表达的现象,大约比雌配子体提前6天表达,与配子产生的顺序同步。
根据海带基因lhcf6编码的蛋白Lhcf6以及GenBank中12个其功能同源蛋白序列利用CLUSTAL X1.8和MEGA2.0软件构建了藻类系统进化树,从光捕获蛋白分子水平表明藻类具有三条演化途径:蓝藻和红藻、杂色藻类、绿藻与高等植物。