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致倦库蚊,是一种重要的传播人类疾病的昆虫媒介,能传播西尼罗病毒、乙型脑炎、班氏丝虫病和圣路易斯脑炎等多种疾病。苄氯菊酯是目前室内最被广泛用来控制蚊虫的拟除虫菊酯药剂,也是非洲唯一被用来处理蚊帐,预防传染疾病的杀虫剂。然而,由于蚊虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性,导致蚊虫防治成为一个世界性的难题。在前期研究中,通过比较致倦库蚊不同抗性品系中基因的转录组表达水平,发现多种P450基因及几种羧酸酯酶基因在抗性种群中过量表达,然而针对P450解毒酶和酯酶在致倦库蚊对拟除虫菊酯代谢抗性中的作用和角色等分子机理方面的研究还不够深入。本论文主要利用杆状病毒表达系统成功表达了致倦库蚊的8个P450基因和3个羧酸酯酶基因,并通过体外代谢实验和sf9昆虫细胞苄氯菊酯毒性实验,证明这些P450s和羧酸酯酶能代谢苄氯菊酯,从功能上揭示了相应基因的过量表达介导了致倦库蚊对苄氯菊酯抗药性产生。具体研究结果如下:1.苄氯菊酯对致倦库蚊P450基因的诱导效应研究为了筛选出与苄氯菊酯抗药性有关的P450基因,在敏感种群、两个抗性种群的致倦库蚊中,研究了苄氯菊酯对多种P450基因的过量表达的诱导效应。结果表明,两个抗性种群HAmCqG8和MAmCqG6中分别有7个和11个P450基因能被LC50浓度的苄氯菊酯诱导表达,其中,CYP9J34、CYP9M10和CYP9J45等3个P450基因,能同时在这两个抗药性种群中被诱导表达。表明,抗性品系中P450基因的诱导表达和持续过量表达,提高了总的P450酶表达水平,介导了杀虫剂的抗药性产生。因此,这些P450基因有可能参与了致倦库蚊对苄氯菊酯的代谢抗性。2.P450与细胞色素P450氧化还原酶(CPR)共表达的条件优化本论文首先针对利用昆虫-杆状病毒表达系统共表达CYP9M10和CPR,进行表达条件的优化,从而为成功表达其他P450蛋白奠定基础。主要通过评价共表达的CYP/CPR复合体催化7-乙氧基香豆素的O-脱乙基活性(ECOD活性),优化了在表达系统中血红素前体的添加量。结果表明,0.1mM5-ALA 和 0.02mMFe3+或1μg/mLhemin 和 0.1mM5-ALA一起添加使用时,表达得到的CYP9M10的催化活性要大于只添加1ug/mL氯血红素或其他条件下所表达的CYP9M10/CPR活性。同时,还用ECOD活性为依据,优化了 CYP9M10与CPR感染复数的最佳比率。结果表明,在悬浮培养表达中,CYP9M10:CPR最合适的感染复数比为0.2:0.02或0.5:0.05(比率是 10)。3.体外表达P450s及其对苄氯菊酯代谢利用优化获得的昆虫杆状病毒表达系统,成功表达了 8个P450蛋白:CYP9M10、CYP6AA7、CYP9J34、CYP9J33、CYP9J40、CYP9J45、CYP6BZ2 和 CYP6P14,获得了 具有催化活性的P450/CPR微粒体蛋白。苄氯菊酯sf9细胞毒性实验表明,CYP9M10和CYP6AA7在sf9细胞体内的表达增加了 sf9细胞对苄氯菊酯毒性的耐受力。体外代谢实验和HPLC检测表明,与不添加NADPH的对照相比,CYP9M10和CYP6AA7代谢苄氯菊酯的催化活性分别为0.49 pmol/mim/pmol P450和 0.56 pmol/min/pmol P450,其中,PBOH(间苯氧基苯甲醇)是在本文条件下检测到的唯一的代谢产物。CYP9M10和CYP6AA7均能将PBOH和PBCHO(间苯氧基苯甲醛)转化为代谢终产物PBCOOH(间苯氧基苯甲酸)。PBOH和PBCHO对sf9细胞的毒性实验分别表明,CYP9M10和CYP6AA7在sf9细胞体内表达增加了 sf9细胞对PBOH和PBCHO毒性的耐受力。PBOH,PBCHO和PBCOOH对致倦库蚊三龄幼虫毒力测定表明,PBOH和PBCHO对幼虫的毒性是PBCOOH的18倍左右;抗性种群HAmCqG8幼虫对PBOH和PBCHO的敏感性比敏感种群下降了 3倍。证明,致倦库蚊代谢PBOH和PBCHO对抗性种群解毒苄氯菊酯具有重要的作用。HPLC检测表明,其它P450蛋白CYP9J34、CYP9J33、CYP9J40、CYP9J45、CYP6BZ2和CYP6P14也都能代谢苄氯菊酯,代谢反应速率分别为:51.1、44.5、53.4、35.4、50.7和50.9 pmol/min/mg。苄氯菊酯sf9细胞毒性实验也表明,表达了CYP9J34、CYP9J33、CYP9J40、CYP9J45、CYP6BZ2 和 CYP6P14 的 sf9 细胞对苄氯菊酯毒性的耐受性增强了,证明 CYP9J34、CYP9J33、CYP9J40、CYP9J45、CYP6BZ2、CYP6P14 在细胞中对苄氯菊酯的代谢具有解毒的作用。4.致倦库蚊中与节氯菊酯抗药性相关的3个羧酸酯酶的功能研究本论文通过荧光定量PCR验证了 3个羧酸酯酶在抗性种群HAmCqG8中分别过量表达,而且与成虫相比,均在幼虫中高水平表达。通过昆虫杆状病毒表达系统获得了具有功能的酯酶蛋白。用标准底物α-乙酸萘酯检测所表达的酯酶的活性,表明,CPIJ018231对乙酸-1-萘酯具有很好的代谢活性,而CPIJ018232和CPIJ018233对底物乙酸-1-萘酯的代谢活性只CPIJ018231的十分之一左右。苄氯菊酯的细胞毒性实验表明,CPIJ018231、CPIJ018232和CPIJ018233在细胞中表达均对苄氯菊酯有解毒的作用,其中CPIJ018232的解毒作用最好,CPIJ018231次之。体外代谢实验以及HPLC分析表明,CPIJ018232的代谢能力几乎是CPIJ018231的两倍。虽然CPIJ018233代谢苄氯菊酯的能力较弱,但是仍然可以检测到苄氯菊酯底物的消耗和代谢产物PBOH的生成。这些结果表明,与CPIJ018231相比,CPIJ018232对模式底物乙酸-1-萘酯的代谢活性降低了,但是却获得了更高的苄氯菊酯的代谢活性。构建了三维蛋白结构模型和由计算机模拟的对乙酸-1-萘酯和苄氯菊酯的对接模式。结果验证了 CPIJ018231、CPIJ018232和CPIJ018233对乙酸-1-萘酯和苄氯菊酯代谢能力,与本论文的代谢实验结果一致。综上所述,通过对在致倦库蚊抗性品系中过量表达的P450基因及羧酸酯酶基因进行了体外蛋白表达和代谢研究,证明这些过量表达的P450基因,CYP9M10、CYP6AA7、CYP9J34、CYP9J33、CYP9J40、CYP9J45、CYP6BZ2、CYP6P14 和 3 个过量表达的羧酸酯酶基因,CPIJ018231、CPIJ018232和CPIJ018233,均能够代谢苄氯菊酯,共同介导了致倦库蚊对苄氯菊酯的抗药性发展。