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肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是单股正链RNA病毒、具有嗜神经性,属于微小RNA病毒科肠道病毒属人类肠道病毒A型,是近年来亚太地区手足口病(Hand,foot,and mouth disease,HFMD)持续爆发流行的主要病原体。EV71重症感染常导致急性脑损伤(Acute brain injury,ABI),临床上表现为严重的中枢神经系统综合征,包括无菌性脑膜炎、急性整体性软瘫和脑炎。脑炎常发生在脑干,导致严重的神经源性肺水肿和心肺综合征,患儿不是快速死亡就是愈后伴有严重后遗症。目前,仍没有治疗重症手足口病患儿的特效药物。阐明EV71重症感染急性脑损伤的免疫病理分子机制,将为重症手足口病的预警、治疗提供关键的分子靶标,加速治疗重症手足口病的药物研发进度。EV71感染中枢神经系统(Central nervous system,CNS)后,不仅会直接造成神经元细胞的凋亡,而且会诱导CNS不同区域的炎症细胞浸润和全身的细胞因子风暴(Cytokine storm,CS),造成与急性脑损伤相关的中枢神经系统综合征。EV71感染导致的严重炎症可能发生在中枢神经系统的不同区域,包括脑皮质、脑干和脊髓。同时,EV71引起的以细胞因子风暴为特征的全身性炎症反应也可以引起EV71重症感染相关的疾病。虽然对EV71感染神经元细胞凋亡的分子机制认识比较深入,但是对EV71重症感染造成急性脑损伤的免疫病理分子机制的研究还处于起步阶段。本研究对EV71重症感染急性脑损伤的免疫病理机制进行了初步探索,为防治EV71重症感染提供了潜在的诊断和治疗分子靶标,结果如下:(1)从来自中国大陆不同地区的534份手足口病临床样本中经分离、鉴定,获得78株EV71;为获得阐明致死性免疫病理机制的候选强毒株,利用腹腔注射乳鼠方式对每一株EV71病毒进行了毒力测定。选择3株EV71强毒进行小鼠细胞和乳鼠进行传代驯化,以进一步增强对小鼠的毒力,结果获得了2株稳定的EV71乳鼠强毒株,分别是BJ09/07株(Gen Bank accession NO.JQ319054?,简称EV71-BJ)和TS株(Gen Bank accession NO.JQ708210.1,简称EV71-TS);成功建立了2个EV71感染乳鼠模型,选择更能反映EV71重症患儿临床特征及免疫病理特点的EV71-TS感染乳鼠模型进行后续研究;(2)为阐明EV71致死性感染病理机制所涉及的免疫细胞群,利用血常规分析、流式细胞术和免疫荧光技术,对EV71感染患儿和乳鼠模型中外周血、脑脊液/脑研磨液的白细胞类群进行了全景扫描;利用Luminex技术对血清、脑脊液/脑研磨液中的细胞因子和趋化因子谱进行了全景扫描;利用生物统计学比较它们之间的差异和规律,发现中性粒细胞和单核巨噬细胞在EV71重症感染者脑组织中显著升高,同时,CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、GCSF和IL-6在EV71重症感染者的外周血和脑脊液中显著升高,而CCL2、CCL3升高幅度最大,它们在EV71感染导致的ABI和CS过程中可能发挥重要功能作用,作为候选的EV71重症感染急性脑损伤中的关键危险因子;(3)在EV71-TS感染乳鼠模型基础上,利用阻断性中和抗体1A8敲低中性粒细胞将会显著提高EV71感染乳鼠的存活率,而利用六水合氯化钆敲低单核巨噬细胞对EV71感染乳鼠的存活率没有影响;同时,利用阻断性中和抗体敲低CCL3将会显著提高EV71感染乳鼠的存活率,与同型对照抗体处理的对照乳鼠1周内100%的死亡率相比较,使用阻断性中和抗体敲低CCL3的乳鼠感染后2周仍有30%的生存率;而利用阻断性中和抗体敲低CCL2对EV71感染乳鼠的存活率没有影响。EV71感染CCL3 KO或者CCL2 KO乳鼠进一步证明CCL3在EV71致死性感染中发挥重要作用,与野生型对照乳鼠1周内100%的死亡率相比较,CCL3 KO乳鼠感染EV71两周后仍有60%的生存率,而CCL2 KO乳鼠显示与野生型乳鼠有相似的死亡率。流式细胞术试验和免疫荧光试验表明CCL3敲除后阻止了中性粒细胞向脑组织的募集,而CCL2敲除没有显著影响;Transwell试验进一步证明CCL3是EV71感染后中性粒细胞向脑内募集的主要因子。MPO活性试验、中性粒细胞氧化呼吸试验和免疫荧光试验证明CCL3能直接激活中性粒细胞,以上试验暗示在EV71重症感染中CCL3能趋化中性粒细胞向脑组织浸润并活化之,这些效应由CCL3/CCR1/CCR3(人)和CCL3/CCR5(小鼠)所介导。通过深度测序技术和生物信息学研究,发现与EV71感染相关的5个上调表达的micro RNA可能靶向于CCL3,包括2个人的和3个鼠的micro RNA;通过免疫蛋白质杂交试验和荧光素酶报告试验证明CCL3在转录水平上通过PI3K-NF-κB信号通路调控,而在转录后水平其在一定程度上受micro RNA的调控。目前,救治EV71重症患儿主要依赖于抗炎制剂(糖皮质激素、免疫球蛋白)及强心剂(肾上腺素、米力农),尚缺乏靶向EV71感染免疫病理损伤通路的特异性治疗药物。本研究揭示了CCL3介导中性粒细胞浸润及活化显著加重了EV71感染的免疫脑损伤,鉴于人类CCL3及相应受体的抑制剂在临床试验中对人体是安全的,也可能是治疗重症EV71感染的有效药物;另外,在EV71重症感染中新发现的对CCL3表达调控发挥重要作用的PI3K-NK-κB通路和micro RNA分子,也可能是治疗EV71致死性感染的潜在药物靶标。