论文部分内容阅读
苏云金芽胞杆菌在芽胞形成时产生杀虫晶体蛋白,杀虫晶体蛋白基因由cry基因编码。cry基因的表达调控十分复杂,不同类型的cry基因具有不同的表达调控方式,以前研究认为cry基因启动子类型大致划分为两类:一类是依赖于芽胞形成的;一类是不依赖于芽胞形成的。大部分已知的cry基因启动子为依赖于芽胞形成的启动子类型,受芽胞形成相关调节因子σE和σK调控,cry1Ac被认为是典型的依赖芽胞形成的cry基因。本文主要围绕cry1Ac基因在生长过渡期(芽胞未形成)的表达调控开展研究。采用基因融合表达技术获得了cry1Ac-gfp融合表达基因,构建到拷贝数不同的B. thuringiensis表达载体上,获得融合表达载体pHT304-cry1Ac-gfp和pHT315-cry1Ac-gfp,以HD-73无晶体突变株为受体通过电击转化获得质粒融合表达菌株HD-73-(304CG)和HD-73-(315CG)。采用基因重组技术将gfp基因插入到大质粒pHT73的cry1Ac基因的3’端上,获得原位融合菌株HD-73Φ(CG)。激光共聚焦显微镜分析结果表明,HD-73Φ(CG)、HD-73-(304CG)和HD-73-(315CG)菌株细胞中能检测到Cry1Ac-GFP融合蛋白的表达。SDS-PAGE和Western分析表明,HD-73-(315CG)菌株在t2时检测到Cry1Ac-GFP融合蛋白的表达,因此推测cry1Ac基因的表达有可能在过渡期开始。为进一步明确cry1Ac基因在过渡期是否存在表达,采用丰富培养基LB对HD-73-(304CG)和HD-73-(315CG)进行激光共聚焦显微镜和Western分析。激光共聚焦显微镜结果表明HD-73-(315CG)菌株细胞在生长过渡期(t6)时可检测出Cry1Ac-GFP融合蛋白表达发出的荧光。Western分析HD-73-(304CG)、HD-73-(315CG)和HD-73野生菌株中Cry蛋白的表达,t-1、t0和t1时均检测到Cry蛋白的表达。以上结果表明cry1Ac基因在生长对数期和过渡期开始表达。已知cry1Ac基因的启动子是双启动子(BtI和BtII),由σE和σK识别。Spo0A是进入芽胞期关键的调节因子,通过同源重组获得spo0A基因缺失插入突变体HD-73(Δspo0A)。将pHT315-cry1Ac-gfp电击转化到HD-73(Δspo0A)和HD-73(ΔsigE)突变体中进行激光共聚焦显微镜分析。结果表明,HD-73Δspo0A(315CG)和HD-73ΔsigE(315CG)突变体中均能检测出Cry1Ac-GFP融合蛋白的表达。这说明cry1Ac基因在生长对数期和过渡期的表达不依赖于Spo0A和σE。PlcR在B. thuringiensis中是细胞外毒力因子的调节子,在生长对数期结束和过渡期起调控作用。通过同源重组获得plcR基因缺失突变体HD-73(ΔplcR),SDS-PAGE分析结果表明plcR基因的缺失不影响Cry1Ac蛋白的表达量。构建了截短cry1Ac启动子转录分析载体pHT304-T1Acp-lacZ。转录活性分析结果表明:在SSM和LB中,截短cry1Ac启动子片段(-1到-134bp)的转录活性显著高于长cry1Ac启动子片段(-1到-368bp)的转录活性。说明ATG上游-134到-368之间存在cry1Ac基因转录的抑制因子。