【摘 要】
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在我国柑橘上有两种显然不同的链格孢菌病害,即柑橘黑腐病(Alternaria black rot,ABR)和褐斑病(Alternaria brown spot,ABS)。前者主要引起成熟后贮运期果实的腐烂,后者则引起生长期的落叶、枯梢和落果。虽然病害不同,但褐斑病菌和黑腐病菌在形态学上很难区分,以致对两者的分类地位和学名使用上存在较多的争议。近些年链格孢属真菌的分类有了长足的进展,对种的界定有了比
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在我国柑橘上有两种显然不同的链格孢菌病害,即柑橘黑腐病(Alternaria black rot,ABR)和褐斑病(Alternaria brown spot,ABS)。前者主要引起成熟后贮运期果实的腐烂,后者则引起生长期的落叶、枯梢和落果。虽然病害不同,但褐斑病菌和黑腐病菌在形态学上很难区分,以致对两者的分类地位和学名使用上存在较多的争议。近些年链格孢属真菌的分类有了长足的进展,对种的界定有了比较统一的标准。本研究根据最新的链格孢属真菌的种界定标准,基于Alta1、endoPG、LSU、OPA10-2、OPA1-3和OPA2-1等6个基因位点串联序列,对中国境内采集的49株柑橘黑腐病菌菌株和8株柑橘褐斑病菌菌株进行系统发育分析,以期明确这个两个病菌的种属关系,并确定其种名。结果表明,在上述串联序列所构建的系统发育树上柑橘黑腐病和褐斑病菌株并没有形成两个独立的分支,两者均分布在交链格孢菌(Alternaria alternata)和盖森链格孢菌(A.gaisen)的两个分支中,说明两个病害的病原菌均有交链格孢菌和盖森链格孢菌。结合前人的工作,引起褐斑病的链格孢菌均含有ACT毒素基因簇,均能产生ACT毒素,对叶梢和果实致病,而引起柑橘果实黑腐病的链格孢菌则不一定,为了能从病原学名上反映出两种病害的显著差异,我们建议采纳日本学者使用致病型的方式来命名柑橘褐斑病病原,学名为the tangerine pathotype of A.alternata和the tangerine pathotype of A.gaisen,即交链格孢菌橘致病型和盖森链格孢橘致病型;考虑到引起柑橘黑腐病的链格孢菌并不需要ACT毒素基因簇,柑橘黑腐病病原学名使用A.alternata和A.gaisen,即交链格孢菌和盖森链格孢菌,摒弃原来的柑橘链格孢菌(A.citri)。正确的学名能为学术交流和病害防控提供帮助。柑橘褐斑病菌产生的寄主专化性毒素ACT是主要的致病因子,同时病菌对ROS的解毒系统对其正常生长发育和致病力有着重要的作用。已有的研究表明柑橘褐斑病菌的NADPH氧化酶(Nox)复合物中的催化亚基AaNoxA和AaNoxB,调节亚基AaNoxR在ROS的产生和清除,菌丝生长和产孢,以及致病等方面扮演重要的角色。本研究期望明确Nox复合物中的其他组分的功能。本研究首先鉴定了两个Nox复合物中的Rho GTPases AaCdc42和AaRacA。结合前人的研究,我们通过酵母双杂交证实柑橘褐斑病菌中的AaCdc42和AaRacA可分别与AaBemA和AaNoxR的互作,且其互作的关键氨基酸是AaCdc42上的29K和AaRacA上的61W。为明确AaCdc42和AaRacA的功能,我们构建了AaCdc42和AaRacA基因敲除突变体ΔAaCdc42和ΔAaRacA、回补突变体ΔAaCdc42-C和ΔAaRacA-C。我们另外将AaCdc42 29位氨基酸K对应的基因序列进行突变并回补回ΔAaCdc42中,得到点突变回补菌株ΔAaCdc42-CK29A。ΔAaCdc42-CK29A菌株内AaCdc42K29A不能与AaBemA互作。同样的,我们另外将AaRacA 61位氨基酸W对应的基因序列进行突变并回补回ΔAaRacA中,得到点突变回补菌株ΔAaRacA-CW61F。ΔAaRacA-CW61F菌株内AaRacAW61F不能与AaNoxR互作。表型比较和分析发现AaCdc42参与菌丝生长,产孢,H2O2的产生和致病力,但AaCdc42与AaBemA互作仅在H2O2的产生过程中起作用。而AaRacA参与产孢,H2O2的产生,对ROS的抗性和致病力,均依赖与AaNoxR的互作。同时研究还发现在缺失突变体ΔAaCdc42和ΔAaRacA突变体中AaNoxA,AaNoxB和AaNoxR的表达量均显著下降,可见AaCdc42和AaRacA是Nox复合物的调控子。另外我们发现AaRacA和AaCdc42双敲突变体致死。研究结果丰富了对Nox复合物的功能及其组分间协调方面的知识。
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