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第一部分胰岛β细胞的脂性凋亡及其机制
目的:证实脂毒性诱导胰岛β细胞凋亡;探讨脂毒性诱导β细胞凋亡的途径。
方法:体外培养胰岛β细胞，随机化分为:
①正常对照组(BSA):含0.5％BSA的DMEM培养基培养24小时。②棕榈酸组(PA):加入0.4mmol/l的棕榈酸(含0.5％BSA)培养24小时。③油酸脂组(OA):加入0.4mmol/l的油酸脂(含0.5％BSA)培养24小时。④Z-LEHD-FMK组(LEHD):40uM Z-LEHD-FMK预孵2小时后，加入0.4mmol/l的棕榈酸(含0.5％BSA)培养24小时。⑤Z-IETD-FMK组（IETD）:40uM Z-IETD-FMK预孵2小时后，加入0.4mmol/l的棕榈酸(含0.5％BSA)培养24小时。⑥Z-LEHD-FMK联合Z-IETD-FMK(LEHD/IETD)组:40uM Z-LEHD-FMK及40uMZ-IETD-FMK联合预孵2小时后，加入0.4mmol/l的棕榈酸(含0.5％BSA)培养24小时。
采用Annexin V-Cy3凋亡试剂盒检测细胞凋亡，Western blotting检测Cleaved caspase-3、8、9蛋白的表达。
结果:与对照组及油酸脂组比较，棕榈酸组Cleaved caspase3的表达增加(p＜0.05)，凋亡细胞数目明显增加(p＜0.01)，且内源性凋亡途径的Cleaved caspase8(p＜0.05)及外源性凋亡途径的Cleaved caspase9表达也增加(p＜0.01)，而Cleaved caspase9的升高更显著。使用Caspase抑制剂后发现，Z-LEHD-FMK（Caspase9抑制剂）显著减少Cleavedcaspase3的表达(p＜0.05)，而Z-IETD-FMK（Caspase8抑制剂）对Cleaved caspase3的表达有减少趋势，但没有统计学意义。同时使用Z-LEHD-FMK（Caspase9抑制剂）及Z-IETD-FMK(Caspase8)不能完全抑制棕榈酸诱导的Cleaved caspase3的表达。
结论:脂毒性通过同时激活内源性及外源性凋亡途径导致胰岛β细胞凋亡，其中内源性凋亡途径可能起着主要作用。脂毒性诱导的Cleaved caspase3激活中可能还存在非Caspase8及Caspase9的诱导因素。
第二部分脂联素抗脂性凋亡及其机制
目的:证实脂联素的抗凋亡特性;初步探讨脂联素抗脂性凋亡的机制。
方法:体外培养胰岛β细胞，随机分为①正常对照组(BSA):含0.5％BSA的DMEM培养基培养24小时。②棕榈酸组(PA):加入0.4mmol/l的棕榈酸(含0.5％BSA)培养24小时。③脂联素组OA）:加入脂联素预孵2小时后，加入0.4mmol/l的棕榈酸(含0.5％BSA)培养24小时。
采用Annexin V-Cy3凋亡检测细胞凋亡情况，Western blotting检测Cleaved caspase-3、8、9及Bax、Bcl-2蛋白的表达。
结果:与单纯棕榈酸组比较，脂联素预孵后Cleaved caspase3的表达减少、胰岛β细胞凋亡数目减少(p＜0.01); Cleaved caspase9表达减少(p＜0.05);而Cleaved caspase8的表达有减少趋势，但没有统计学意义。脂联素预孵后，Bax表达减少， Bcl-2表达增加(p＜0.05)。
结论:脂联素具有抗脂性凋亡的作用，脂联素对内源性及外源性凋亡途径均有抑制作用，但对内源性凋亡途径的抑制作用可能起着主要作用。脂联素通过调节Bax、Bcl-2的表达抑制内源性凋亡途径。
第三部分表达小鼠脂联素蛋白的重组慢病毒载体干预糖尿病
目的:构建表达小鼠脂联素的重组慢病毒载体;通过慢病毒载体提高血循环脂联素浓度;探讨提高血循环脂联素浓度对糖尿病的干预作用。
方法:构建表达小鼠全长脂联素蛋白的重组慢病毒载体（携带绿色荧光蛋白）。小剂量链脲菌素多次注射联合高脂饮食喂养建立2型糖尿病小鼠模型。随机分组:(1)正常对照组(Control):普通饮食喂养6周。(2)2型糖尿病组:小鼠禁食16小时后腹腔注射链尿菌素（55mg/kg体重，每天一次，连续5天），继续高脂饮食喂养4周。以随机血糖浓度＞16.7mmol/L为糖尿病造模成功标准。4周后成膜的糖尿病小鼠随机分为①生理盐水注射组(Saline):尾静脉注射生理盐水100ul，继续高脂饮食喂养2周。②脂联素干预组(Plenti-Acdc-EGFP):尾静脉注射表达小鼠脂联素的重组慢病毒载体100ul，病毒滴度为1×108 ifu/ml，继续高脂饮食喂养2周。③空病毒载体注射组(Plenti-EGFP):尾静脉注射空病毒载体100ul，继续高脂饮食喂养2周。
采用荧光显微镜观察肝脏绿色荧光表达情况;Western blotting检测肝脏脂联素蛋白的表达;Elisa法检测血循环中脂联素的水平;TUNEL法检测胰岛凋亡;免疫组化检测Cleaved caspase3、8、9的表达;化学法检测血脂水平。指血糖仪检测血糖水平。
结果:小剂量多次链脲菌素注射联合高脂饮食喂养法成功建立了2型糖尿病小鼠模型，其血脂、血糖水平明显高于正常对照组(p＜0.01)。
慢病毒尾静脉注射14天后，肝组织冰冻切片，荧光显微镜下见大量绿色荧光表达于脂联素干预组及空病毒载体注射组，而正常对照组及生理盐水注射组未见绿色荧光表达。Western blotting显示仅脂联素干预组见脂联素蛋白表达。Elisa检测结果显示脂联素干预组血脂联素水平明显高于其他三组(p＜0.01)，为48.03±3.79ug/ml，空病毒载体组与生理盐水组水平相似，但显著低于正常对照组(p＜0.05)。
与正常对照组比较，生理盐水注射组及空病毒注射组体重下降、血糖、血脂水平升高(p＜0.01)。生理盐水注射组及空病毒注射组两组间比较，没有统计学差异意义。
与生理盐水注射组及空病毒注射组比较，脂联素干预组血糖降低(p＜0.05)，甘油三脂水平也降低(p＜0.01)。脂联素干预组胰岛β凋亡细胞数目明显减少(p＜0.05)，胰岛Cleaved caspase3、8、9的表达显著降低(p＜0.01)。
结论:小剂量STZ联合高脂饮食喂养法能成功构建2型糖尿病小鼠模型;慢病毒载体可用于基因治疗提高脂联素水平;提高血循环脂联素水平可抗胰岛β细胞凋亡、改善糖脂代谢，干预糖尿病。