板蓝根多糖的分离纯化及抑制流感病毒神经氨酸酶活性的研究

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流感是发病率最高的传染性疾病之一,严重危害着人类的健康。近年来高致病性禽流感和H1N1流感的肆虐引发了民众恐慌等一系列的社会问题,造成了严重的经济损失,也影响了社会的安定团结。因此抗流感病毒药物的研发成为当今研究的热点问题和社会的迫切需要。因为板蓝根在临床上的抗病毒抗菌作用明显,用量之大,堪称中成药之最,所以板蓝根成为我们研发抗流感药物的首选原材料。其中板蓝根多糖是板蓝根的主要活性成分,是研究板蓝根抗流感病毒的重点。本论文即以板蓝根为原料,提取并分离了板蓝根多糖,研究了板蓝根多糖抑制流感病毒神经氨酸酶的活性,寻找板蓝根多糖中抗流感病毒的活性成分,明确多糖的结构与抑制流感病毒神经氨酸酶的活性之间的关系,为开发多糖类抗流感病毒药物提供理论基础。首先采用热水煮提的方法从板蓝根中提取到水溶性总多糖;将提取液浓缩,80%乙醇醇沉,常规干燥得到了板蓝根总多糖IRP,收率为10.0%。测定了板蓝根总多糖IRP的基本物理性质,分别为:苯酚-硫酸法测得总糖含量为75.9%;碘显色法测得淀粉含量为62.5%;间羟基联苯法测得糖醛酸含量为8.3%;考马斯亮蓝法测得蛋白含量为1.5%。单糖组成分析发现IRP主要由Glc(65.9%)构成,另外还含有少量GalA(11.7%)、Rha(2.6%)、Ara(10.9%)、Gal(6.2%)和Xyl(1.9%)。然后采用DEAE-纤维素离子交换柱层析法对板蓝根总多糖IRP进行分级,得到了蒸馏水洗脱的板蓝根中性糖级分IRPN和0.5M NaCl洗脱的板蓝根酸性糖级分IRPA。分别对这两种板蓝根多糖级分进行了分子量和电荷的均一性分析、单糖组成分析和红外光谱分析。发现IRPN是一种主要由Glc构成的淀粉样葡聚糖,其多糖分子在Sepharose CL-6B层析柱上分布较宽,说明IRPN的分子量分布不均一,但由于其为中性糖,进一步分离纯化比较困难,暂不做深入研究。而IRPA在Sepharose CL-6B层析柱上总糖和糖醛酸的分布情况一致,为一个分布较宽的吸收峰;在DEAE-Sepharose fast flow层析柱上呈现均一对称峰,说明IRPA的分子量和电荷分布均相对均一,结合单糖组成和红外分析结果推测IRPA主要由HG型果胶结构域和含有半乳聚糖、阿拉伯聚糖或阿拉伯半乳聚糖侧链的RG-I结构域构成,并且果胶的甲酯化程度较低。之后对板蓝根总多糖IRP和两个多糖级分IRPN和IRPA进行抑制流感病毒神经氨酸酶的活性分析。分别采用实验室建立的生物发光法和以4-MUNANA为底物的经典荧光法研究板蓝根多糖各级分抑制流感病毒H1N1、H5N1神经氨酸酶的活性。两种方法测得的变化趋势一致,实验结果相同。结果表明,酸性糖的抑制活性明显强于中性糖和总糖,对H1N1和H5N1神经氨酸酶的IC50均在6mg/mL以下,而且对H5N1流感病毒神经氨酸酶的抑制活性略强于H1N1。可以确定酸性糖是板蓝根多糖中抑制流感病毒神经氨酸酶的主要活性成分,推测酸性糖较高的抑制流感神经氨酸酶活性与其结构中的羧基有关。
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