研究背景心血管疾病目前仍然是全球范围内发病率和死亡率最高的疾病,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠心病、心肌梗死和脑卒中等心脑血管疾病的主要原因。动脉粥样硬化的病理生理机制为血管内慢性、持续性炎症反应,炎性反应可以引起血管内皮损伤,血管内皮损伤进一步加重炎性反应。在炎症过程中会引起细胞的自噬、凋亡、坏死等细胞损伤,近年来细胞自噬在炎症反应中的作用也逐渐被人们所关注。自噬和炎症反应广泛参与机体多种病理生理学过程。炎症反应是机体应对病原体或组织损伤等刺激的一种保护性反应,但过度的炎症反应,会导致机体组织的损伤及疾病的发生。自噬通过清除破坏细胞的无菌刺激物或病原体,来实现其保护细胞和组织及抗炎等作用。越来越多的研究证明,自噬通过抑制炎性体途径直接调控炎性细胞因子的分泌。炎性小体是识别微生物产物的细胞质复合物,负责上调白介素1β(IL-1β)等炎性细胞因子的分泌,来保护宿主。由于异常激活的炎性小体会引起过度的炎症反应并导致严重的组织损伤,因此严格控制炎性小体激活对于细胞的保护发挥重要的作用。MiR-210被认为是体内最重要的缺氧相关miRNA,是由20-24个核苷酸组成的小非编码RNA,是高度保守的单链RNA,它们通过与靶mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)上的互补序列结合来调节基因表达,从而抑制mRNA翻译或促进mRNA降解。已确定的多种miR-210靶基因显示,其不仅参与了能量代谢、血管生成,而且在自噬、凋亡、炎症等过程中也发挥了非常重要的作用。本课题组之前研究发现,miR-210可以抑制缺氧诱导的H9c2细胞自噬与凋亡。然而,对LPS刺激条件下的冠状动脉内皮细胞自噬和炎症的作用以及其分子机制尚不清楚。ATG7是一类泛素化激活酶,也是两个泛素化结合系统共享的蛋白,在自噬膜延伸过程中发挥重要作用,是一种调控自噬的有效靶点。查阅文献发现,miR-210可直接与ATG7mRNA的3’UTR结合,发挥其抑制细胞自噬的作用。ATG7除了参与细胞自噬过程外,它在调控炎症方面的功能也得到了重视,且有研究证实ATG7的缺失导致IL-1β表达及NLRP3通路激活。然而,miR-210是否通过调控ATG7影响冠状动脉内皮细胞自噬及NLRP3依赖的炎症反应尚不清楚。研究目的本研究以HCAEC人冠状动脉内皮细胞为研究对象,应用LPS刺激构建炎症模型,研究miR-210在炎症过程中对自噬和炎症的影响及作用机制。并以ATG7为切入点,研究在上述过程中对自噬、炎症的调控作用。从而为miR-210应用于心血管疾病的预防与治疗提供新的线索和思路。研究方法1.应用LPS处理HCAEC细胞,构建炎症损伤模型。使用CCK-8活性检测试剂盒检测细胞生存率,乳酸脱氢酶检测试剂盒检测LDH释放量。通过Western blot检测炎症过程中LC3B,Beclin1等自噬相关蛋白的表达,并通过免疫荧光染色观察LC3B的点状聚集,观察LPS诱导下自噬的变化,并检测细胞中炎症相关蛋白IL-1β,Caspase-1,NLRP3的表达,探究LPS对NLRP3依赖的炎症相关蛋白表达的影响。2.应用实时定量PCR检测不同时间点的LPS刺激下miR-210的表达水平。通过慢病毒转染,构建miR-210高表达、低表达细胞模型,再次检测细胞活性、LDH释放量,观察miR-210对HCAEC细胞活性及损伤的影响。利用Western blot法检测LC3B,Beclin1蛋白的表达,并通过免疫荧光染色观察LC3B的点状聚集。研究miR-210对自噬的影响。利用Western blot法检测IL-1β,Caspase-1,NLRP3蛋白的表达,来探究miR-210对炎症的作用。应用3-MA抑制自噬,通过HCAEC细胞活性检测,LDH释放量检测,自噬相关蛋白LC3B,Beclin1和炎症相关蛋白IL-1β,NLRP3,Caspase-1表达的Western blot检测,探究自噬在LPS诱导的炎症模型中的作用。3.应用Western blot检测LPS诱导的炎症过程中ATG7蛋白的表达变化,并对miR-210高表达及低表达细胞中ATG7蛋白进行检测,探究miR-210对ATG7表达的影响。将ATG7的siRNA质粒转染至HCAEC细胞,构建ATG7低表达模型,在LPS刺激下检测细胞活性,并利用Western blot观察LC3B及炎症相关蛋白IL-1β的表达,探究ATG7在LPS诱导的炎症损伤型中的作用及其对自噬及炎症的调控。研究结果1.LPS诱导人冠状动脉内皮细胞发生炎症损伤,降低细胞活性;自噬相关蛋白LC3B,Beclin1表达增加,在共聚焦显微镜下观察LC3B的点状聚集增强,同时NLRP3,IL-1β,Caspase-1蛋白表达上调,且表现出时间依赖性。2.LPS诱导的人冠状动脉内皮细胞中,miR-210表达显著上调;高表达miR-210可以提高LPS诱导下的HCAEC细胞的活性,减少细胞损伤,同时抑制自噬相关蛋白LC3B,Beclin1及NLRP3依赖的炎症相关蛋白表达。而低表达miR-210则会降低细胞的活性,并导致自噬及NLRP3依赖的炎症水平上调。应用3-MA抑制自噬提高了细胞活性,减少细胞损伤,同时细胞自噬及炎症相关蛋白水平均表现出下调。3.MiR-210可以靶向作用于ATG7。LPS可诱导ATG7蛋白表达升高,抑制ATG7的表达导致细胞活性增高,减少自噬相关蛋白及炎症相关蛋白的表达,并可以部分减少miR-210低表达所致的细胞自噬及炎症反应增强。结论LPS可诱导HCAEC细胞自噬及NLRP3依赖的炎性反应,同时诱导miR-210表达增加;miR-210通过抑制靶基因ATG7进而抑制细胞自噬及NLRP3依赖的炎症信号通路,而发挥细胞保护作用。创新点及研究意义本研究证实了LPS可以诱导HCAEC细胞自噬及NLRP3依赖的炎症反应,阐明了在此过程中miR-210通过抑制细胞自噬及炎症发挥细胞保护作用,并且证实了miR-210对自噬和炎症的调控是通过靶向抑制ATG7来实现。本研究从细胞自噬及炎症角度,为miR-210在动脉粥样硬化过程中的保护作用提供新的理论支持,为心血管疾病方面的临床治疗和预防提供了新的科学依据。