甲硫氨酸(Met)是人和动物的必需氨基酸,在生物体内具有重要的生理生化功能。绝大多数植物和微生物可以合成Met,但产量较低,且在不同的生物中,Met的合成途径出现了一定程度的分化。前人对于微生物合成Met的研究已经取得很大的进展,但基本集中在微生物本身,且其产量仍不足以达到产业化的需求。因此,在本研究中,我们试图通过将不同类型生物(植物和微生物)中的Met合成途径进行重新设计组合,利用代谢工程的方法获得一株组合型Met合成菌株,具体的研究结果如下:首先,根据植物中Met合成途径与微生物中的差异,在大肠杆菌W3110中过表达植物中的胱硫醚-γ-合成酶基因CGS和S-甲基甲硫氨酸(SMM)循环中的高半胱氨酸甲基转移酶基因HMT和甲硫氨酸甲基转移酶基因MMT。CGS通过催化O-磷酸高丝氨酸为胱硫醚,将苏氨酸合成流量转移到Met的合成,过表达获得菌株ZM1-C,摇瓶发酵48个小时后,Met的产量可达146 mg/L,是野生型的2倍;同样的,HMT和MMT共同过表达(菌株ZM1-HM)后,Met的产量提高到112 mg/L;接着将CGS、HMT和MMT共同过表达(菌株ZM1-CHM),Met的产量达到287 mg/L,比野生型提高了4倍。因此,植物中的CGS、HMT和MMT对于微生物中Met产量提高具有较大的价值。其次,大肠杆菌内部的代谢调控也是影响Met合成的关键,本研究利用CRISPR-Cas9技术对其内部的代谢途径进行了改造,具体涉及:Met合成过程的阻遏因子met J,其竞争途径赖氨酸和苏氨酸合成途径的lys A和thr C,以及suc CD被敲除,同时关键的调控酶天冬氨酸激酶的编码基因也被定点改造成产物反馈抑制不敏感型的lys C*和thr A*,这些途径的改造最终使Met的含量提高到386 mg/L(菌株ZM15-C)。最后,我们将植物中的CGS-HMT-MMT组合在已经改造后的ZM15菌株中进行过表达,获得的菌株ZM15-CHM在48小时摇瓶发酵产量可达676 mg/L。进一步加上lys C*的过表达后,获得菌株ZM15-CHML的Met摇瓶发酵产量达635mg/L。通过菌株破碎,最终获得的Met的最高产量是ZM15-CHML中的804 mg/L。因此,通过不同物种之间代谢途径的组合可以有效的提高Met的合成效率,同时本研究采用的代谢工程的组合方式也将为其他化合物的合成提供一定的参考。