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口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的能够侵害猪、牛、羊等偶蹄动物的一种烈性传染病,对家畜及其相关产品的国际贸易影响巨大。口蹄疫病毒一共分为7个血清型(O、A、C、Asia 1、SAT 1~3),每个血清型中不仅包含多个具有地域特征的拓扑型,每个拓扑型中还可分为多个谱系。我国O型FMDV是目前防控难度最大的病毒血清型,流行状况复杂,出现了3个拓扑型中4个谱系病毒共存的状况;而A型FMDV是抗原性变异最大的一个血清型。尽管不同血清型间不能提供交叉免疫保护,但是,有历史研究数据表明,经过O、A与Asia 1三种血清型病毒免疫,可以产生对其它血清型病毒的交叉保护,说明不同血清型间存在保守的抗原结构,这种保守的抗原结构能否诱导广谱中和抗体的应答,有待进一步研究。本研究采用3个不同谱系的O型FMDV毒株与1个谱系的A型FMDV毒株间隔一定时间免疫牛。利用Fluo Probes 647H和Pacific Blue分别标记FMDV O型与A型146S病毒粒子作为诱饵抗原,采用流式细胞术从外周血中分离出抗原特异性抗体分泌单个B细胞,从中获取抗体可变区基因,构建完整抗体的真核表达质粒,转染Expi 293 F悬浮培养细胞,进行单克隆抗体的表达与纯化。通过间接免疫荧光实验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western-blot(WB)、病毒中和试验(VNT)来验证抗体的生物学活性。通过本研究,共表达出了56株全牛源IgG单克隆抗体(mAbs),经ELISA和IFA验证后,42株为FMDV特异性mAbs,其中14株mAbs为FMDV O型与A型交互反应性抗体,其余28株mAbs为FMDV单特异性抗体。WB结果显示42株mAbs中有7株mAbs可识别O型与A型抗原中的线性表位,其余判定为构象性抗原表位。56株mAbs中,有21株FMDV中和活性mAbs,其中20株mAbs均对A/GDMM/CHA/2013具有中和作用,该20株m Abs中又有4株mAbs同时对A/WH/CHA/09具有中和作用;21株m Abs中有3株mAbs可中和O型流行毒株,但只有1株(R50)为广谱中和抗体,可以中和FMDV O型与A型不同谱系毒株。应用IMGT数据库对R50的IGHV(D)J和IGLV J胚系基因进行定位分析,结果发现R50不仅含有超长HCDR3,且重链与轻链可变区序列使用牛胚系IGHV 1-7*02基因片段和IGLV 1-47*01/1-52*01基因片段。综上所述,本研究采用两种不同荧光标记的O型与A型146S抗原,利用单个B细胞抗体技术,筛选出了14株FMDV O型与A型交互反应性抗体,其中有1株为O型与A型广谱中和抗体,为解析型间保守的抗原结构奠定了基础。