几丁质是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的多聚合物,是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源。N-乙酰-D-氨基葡萄糖是几丁质的完全降解产物,其在医药、食品、肥料、日化和能源等方面具有广泛的应用价值。目前,几丁质降解的传统方式是化学酸碱法进行降解,而在其降解过程中存在降解产物不纯和产生大量酸碱废液等缺点,使得几丁质资源未得到合理利用。而酶法降解几丁质是一种无污染、低成本、操作简单、产物易控制的高效降解方法。因此,生物酶法代替传统的化学法来生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖,是具有巨大的社会、经济价值以及学术价值的绿色可代替方法,是社会发展的必然。由于天然几丁质的不溶性严重阻碍了酶法降解几丁质的效率,因此,本研究模仿了纤维小体的结构,设计了人工几丁质小体,它能通过蛋白支架Scaf将几丁质内切酶(SaChiB)、几丁质外切酶(SaHex)以及裂解多糖单加氧酶(LPMO)连接起来,协同降解几丁质小体以实现目的酶和底物的空间定位,进而通过不同种类的酶来实现高效降解几丁质的目的。1、本研究根据纤维小体的模式设计了人工“几丁质小体”。通过Linker将几丁质结合结构域(CBD)与3种不同的Cohesin连接构成几丁质小体中重要的蛋白支架Scaf,Scaf不具有降解几丁质的活性。2、PCR扩增三种具有协同作用的几丁质酶基因以及不同来源的Dockerin基因,通过无缝克隆的方法成功得到了重组质粒pET30a(+)-LPMO-Dockerin、pET30a(+)-Dockerin-SaHex、pET30a(+)-SaChiB-Dockerin。3、将带有重组酶基因的三种质粒以及合成的支架蛋白Scaf转入大肠杆菌BL21(DE3)中,并得到了高效表达,重组蛋白及支架蛋白通过Ni-NTA纯化后,等摩尔比进行自组装,经Native-PAGE凝胶检测试验表明,蛋白组装成功。4、对组装后的几丁质小体进行酶学性质试验,结果表明其最适pH为8.0,最适温度为30℃。通过最适酶量试验表明,其最适加酶量为40μM。通过几丁质小体与游离酶降解几丁质效果比较试验表明,在最佳反应条件下,与游离酶组合体系相比,几丁质小体的降解效率提高了2.53倍。