研究背景骨质疏松症,顾名思义是骨质多孔,以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的,骨密度和骨量降低,致使骨的脆性增加,骨折危险性增加的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松症主要分为原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症两大类。据流行病学调查估计,欧美国家和日本约有7500万人患骨质疏松症,患病人数还在不断的增加。美国骨质疏松杂志基金会调查结果显示,依据WHO的诊断标准,绝经后白人女性分别有54%和30%患骨量减少和骨质疏松,大于50岁男性有3%-6%患骨质疏松。据WHO预测,至2050年亚洲65岁以上老年人将达9亿,每年将有320万髋部骨折患者,其中主要原因为骨量减少和骨质疏松。随着我国人口的老龄化,骨质疏松症现在也成为公共健康最严重的问题之一。据我国九五攻关课题调研结果发现：中国人群骨质疏松患病率为22.6%,骨量减少患病率为13.3%。骨质疏松症的严重后果是骨折以及骨折后并发症所致的残疾和死亡,不仅给患者带来痛苦,同时给社会和家庭带来沉重的负担。治疗骨质疏松的基本方法包括基础治疗和药物治疗。其中,基础治疗包括饮食调节、钙剂和维生素D等。药物治疗以促骨形成、抑制骨吸收为基本原则。目前运用于临床的抗骨吸收的药物有如雌激素、二磷酸盐、降钙素、活性维生素D衍生物等。促骨形成药物如氟化物、雄性激素及其衍生物、生长激素、锶盐、PTH片段等。增加骨量促骨形成的代谢药物中,目前仅有甲状旁腺素(Parathyroid Hormone, PTH)获得一致认可(尽管锶盐被认为有一定的促骨形成作用,但需要更多的研究证实)。甲状旁腺激素(PTH)是体内重要的钙稳态调节剂。PTH(1-34)是天然PTH(1-84)的短肽形式,具有相同的结合能力和相同的电位,激活Ⅰ型的PTH受体(PTHR1)。PTH (1-34)已在美国上市治疗骨质疏松,并于2011年10月正式在我国投入临床使用。临床随访观察其具有可靠的抗骨质疏松作用,但仍未达到理想的效果。重要的原因之一是：PTH对骨组织的作用是双向的,即间断小剂量促进骨形成,连续大剂量促进骨吸收。PTH可以调节成骨细胞的生成、转化、增殖或凋亡等各个环节,也促进破骨细胞的骨吸收功能。现认为,PTH对骨组织的作用主要通过与成骨系细胞表面的Ⅰ型PTH受体(PTHR1)结合,对破骨细胞的作用是通过对成骨细胞的影响而间接达到的。PTH影响骨形成和骨吸收功能与其PTHR1引起的多个信号途径有关。与PTHR1结合后,G蛋白偶联的cAMP/PKA信号级联反应被触发,其中包括cAMP/PKA, PLC/PKC和PLC-independent/PKC通道,每条通道都对应至PTH(1-34)的氨基酸序列的关键性区域。其中1位丝氨酸对于PLC的激活是至关重要的,N末端开始的3个氨基酸是cAMP/PKA活化所必须的。我们以前的研究证实,PTH(29-34)对于PLC-independent/PKC信号通路非常重要。随着对PTH(1-34)信号通路的认识加深,我们设计出[Glyl, Arg19]hPTH(1-34)是一个模拟PTH缺乏激活PLC信号通路的模拟肽,第1位丝氨酸(Serl)突变成甘氨酸(Glyl)大幅度失去激活PLC信号的特性。19位谷氨酸突变成精氨酸(Arg19)可以补偿29-34氨基酸残基缺失引起的受体结合力的减弱。该结论已经通过前期的实验证实,间断小剂量注射PTH及其改建缺陷模拟肽能增加胫骨平台下方骨小梁数量和大小,增加全身骨密度。PTH(1-34)促进骨折愈合的作用已在多篇动物实验研究中报道,如间歇性注射PTH(1-34)可提高骨痂的骨密度和骨形成,促进骨折愈合,增加全身骨密度,影响血清成骨标志物形成。尚无文献报道PTH模拟肽作用于骨折愈合的研究。雄激素在生物体内存在广泛的生理作用,尤其是在雄性生殖器官的发育、性成熟和生精功能的维持等方面。其中,雄激素的主要成分为睾酮。有研究报道睾酮对于人的骨骼生长、发育具有重要影响,但随着年龄的增加,人体内睾酮的浓度逐渐降低,低水平睾酮浓度的老年男性容易导致骨转换加快以及增加骨折发生的风险。低睾酮水平的骨微结构变化及其骨折愈合的情况,以前相关的研究十分有限。去睾丸动物骨折后,运用信号选择性甲状旁腺激素模拟肽进行干预,观察骨折愈合的情况,将有利于了解PTH信号通路对于骨折愈合的影响,探讨新药的设计及运用。研究目的1、通过建立雄性小鼠睾丸摘除去势模型,分析研究小鼠去睾丸后血清雄激素水平变化以及小鼠骨量和骨显微结构变化。在此基础上建立股骨骨折模型,观察去势组与对照组之间骨折愈合情况。2、观察甲状旁腺素(PTH)信号选择性模拟肽对去势雄鼠骨折的作用,比较具有不同信号转导通路激活特性的PTH模拟肽对骨折愈合的影响,为PTH促进骨折愈合理论研究和新型骨折愈合刺激药物的发展提供研究资料。研究方法1、雄性小鼠去势模型及股骨骨折模型建立40只7周龄C57BL/6J雄性小鼠,其中8只作为基线组,余下32只随机分为去势组与对照组,该实验通过南方医院动物实验伦理委员会同意。异氟烷气体(300ml/min)吸入诱导麻醉后,通过面罩给氧持续吸入。常规备皮、皮肤消毒,于阴囊皮肤正中线剪开约1cm,暴露双侧睾丸、附睾及周围组织,切除睾丸并缝合阴囊,术毕皮肤消毒。对照组行假手术,切开阴囊皮肤后缝合。去势后1周后建立股骨中段骨折模型,异氟烷气体麻醉后,选择右侧大腿备皮、皮肤消毒,根据小鼠股骨骨折模型文献报道,于右大腿后外侧作切口,从膝关节处逆行插入直径为0.45mm钢针进行髓内固定,钝性分离肌肉及软组织,暴露股骨中段,直视下用手术刀环形切断股骨中段部分,造成横行骨折,逐层缝合肌肉及皮肤,术毕皮肤消毒。术后定期观察伤口愈合情况,所有小鼠均未发生感染,切口愈合良好。骨折后2周及4周,摘除小鼠眼球取血并分离血清。ELISA法测量血清雄激素(睾酮)浓度,运用显微CT测量胫骨平台下2mm骨量及骨微结构,骨折愈合情况通过显微CT显示。应用SPSS13.0统计学软件进行数据处理,计量资料以(x±s)表示；组间比较采用采用两独立样本t检验进行统计学分析。以P<0.05为差别有统计学意义。2、信号选择性甲状旁腺素模拟肽对去势小鼠骨折愈合的影响48只7周龄C57/BL雄性小鼠,摘除睾丸去势后1周制作股骨中段骨折模型,术后随机分为3组,每组16只,模型建立后的第2天开始注射hPTH(1-34)(40ug/kg)、PLC信号缺陷模拟肽G1,R19(1-34)(40ug/kg)和等量的溶解剂。术后2周和4周,双能X线骨密度仪测量骨痂区骨密度。骨折愈合情况通过X线、显微CT、生物力学和组织学显示。结果1.去势后1周,所有小鼠都蜷缩在一起,活动缓慢并且减少,其取食饮水与假手术组基本保持一致。术后2周(骨折术后,以下同),对照组的睾酮浓度为215.83±8.36ng/L,去势组的睾酮浓度为186.16±6.47ng/L,两组之间有显著性差异(P<0.05)。术后4周,对照组的睾酮浓度为224.65±4.51ng/L,去势组的睾酮浓度为94.346±3.96ng/L,两组之间有显著性差异(P<0.05),去势组明显低于对照组。去势后2周,去势小鼠胫骨生长板下2mm处骨小梁减少,骨折处新骨形成较对照明显降低(p<0.05)。BV/TV比例也明显少于对照组。4周时,胫骨生长板下2mm处骨小梁显著减少,骨皮质变薄,骨折处新骨形成较对照更明显降低(p<0.05),BV/TV比例在对照组和去势组较2周时增加,但去势组较少BV/TV(p<0.01)。2.X线检查证实在所有动物骨折端对位对线良好。双能X线骨密度扫描显示,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组具有较高的骨密度(BMD)。2周时,hpTH (1-34)(BMD:45.92±1.62mg/cm2,BMC10.33±0.61mg)和G1,R19(1-34)(BMD49.12±2.11mg/cm2/BMC13.51±1.05mg)处理组的骨密度(BMD)和骨量(BMC)明显高于对照组(BMD33.77±2.17mg/cm2,BMC8.48±0.17mg)。而G1,R19(1-34)较hPTH(1-34)高(p<0.05)。显微CT扫描三维重建图像显示hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组较对照组产生更多的新骨(p<0.05)。4周时,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)基本完成骨折愈合后改建,具有更高的BV/TV。生物力学显示,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组的刚度及最大力明显高于对照组(p<0.05)。组织学分析显示2周时hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组初级骨小梁较多,4周时,hPTH(1-34)和G1,R19(1-34)处理组骨髓腔再通,对照组仍在改建。结论1、睾丸摘除引起雄激素缺乏,可导致骨量丢失和骨折愈合延迟,骨微结构改变。2、G1,R19(1-34)模拟肽不能激发PLC信号途径,但具有不低于PTH(1-34)的促骨折愈合效应,表明该途径在PTH促进骨折愈合中不是必须途径。