非龋性硬化牙本质是牙颈部非龋性缺损底部形成的一种反应性牙本质,其牙本质小管被高度矿化晶体所封闭,可作为隔绝外界刺激进入牙髓的天然屏障。非龋性硬化牙本质的形成机制尚未明确,但机械应力对其形成具有不可忽视的潜在作用。骨硬化蛋白（Sclerostin,SOST）是一种力学敏感蛋白,近来的研究发现其对牙本质形成具有抑制作用,但其在牙本质-牙髓复合体的应力转导中的作用还未曾被研究。成牙本质细胞是牙本质-牙髓复合体中最先感知并传导外界刺激的细胞,且具有分泌牙本质基质、促进牙本质矿化的重要功能,特异性蛋白合成分泌增加是其终末分化过程中最为重要的表型。本研究以非龋性硬化牙本质的形成机制假设为切入点,构建成牙本质样细胞（Human odontoblast-like cells,HODLCs）体外加力模型,探索机械应力刺激下SOST在反应性牙本质形成中的作用及信号通路机制。第一部分SOST抑制拉应力刺激下HODLCs的成牙本质向分化研究目的:研究拉应力刺激下SOST在HODLCs的成牙本质向分化过程中的功能,探索SOST在非龋性硬化牙本质形成过程中的可能作用。材料与方法:收集具有牙颈部非龋性缺损的人离体牙与牙体组织健康的完整牙,制备硬组织切片,用免疫组化染色技术检测非龋性硬化牙本质形成过程中成牙本质细胞内SOST的表达变化;体外诱导培养HODLCs,搭载FX-5000拉应力系统,细胞加力24 h后用q PCR及Western Blot技术检测SOST及牙本质涎磷蛋白（Dentin sialophosphoprotein,DSPP）、骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）、骨钙素（Osteocalcin,OCN）、Runt成骨相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2,Runx2）的表达变化;慢病毒转染构建稳定过表达SOST的HODLCs,加力24小时后q PCR及Western Blot检测DSPP、OPN、OCN、Runx2的表达变化。实验结果:相较于同龄完整牙的颊侧颈部正常牙本质,非龋性硬化牙本质下的成牙本质细胞中SOST的表达量降低;体外拉应力刺激下,HODLCs中SOST表达量降低,而成牙本质分化标志基因DSPP、OPN、OCN、Runx2的表达量升高,且过表达SOST可降低拉应力刺激诱导上调的成牙本质分化基因DSPP、OPN、OCN、Runx2的表达量。结论:SOST表达下调是非龋性硬化牙本质形成过程中成牙本质细胞的一种反应性改变,也是体外拉应力促进HODLCs成牙本质向分化的必要条件。SOST可能参与了机械应力刺激下反应性牙本质的形成。第二部分拉应力通过ERK1/2信号通路与蛋白酶体途径下调HODLCs中SOST的表达研究目的:研究拉应力刺激下HODLCs中SOST与细胞外调节蛋白激酶（Extracellular Signal-regulated Kinase,ERK）1/2信号通路及P38信号通路之间的相互作用,并验证拉应力对HODLC中SOST的下调是否存在蛋白翻译后修饰,探索拉应力刺激下HODLCs中SOST下调的信号通路机制。材料与方法:将HODLCs搭载FX-5000拉应力系统,细胞加力24 h后用Western Blot技术检测磷酸化ERK1/2蛋白、总ERK1/2蛋白、磷酸化P38蛋白、总P38蛋白的表达变化;将HODLCs分别用P38抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059预处理1 h,随后细胞加力24 h,用q PCR及Western Blot技术检测SOST的表达变化;通过慢病毒转染技术构建稳定过表达SOST的HODLCs,细胞加力24小时后用Western Blot技术检测磷酸化ERK1/2蛋白、总ERK1/2蛋白、磷酸化P38蛋白、总P38蛋白的表达变化。将稳定过表达SOST的HODLCs加力24 h后,用q PCR及Western Blot技术检测SOST的表达变化;将未经感染的HODLCs及稳定过表达SOST的HODLCs分别用蛋白酶体抑制剂MG132预处理1 h,加力24 h后用Western Blot技术检测SOST的表达变化。实验结果:拉应力刺激下,HODLCs中ERK1/2通路及P38通路都被激活;PD98059可使拉应力降低的SOST表达量回升,而SB203580对SOST的表达水平没有影响;过表达SOST抑制了拉应力激活的ERK1/2通路,对P38通路的活性没有影响。稳定过表达SOST的HODLCs加力24 h后SOST的m RNA水平没有显著性改变,但蛋白水平出现了明显的降低;在未经感染的HODLCs中及稳定过表达SOST的HODLCs中,MG132都可以逆转拉应力对SOST的下调作用。结论:ERK1/2信号通路与蛋白酶体途径介导了拉应力刺激下HODLCs中SOST的表达下调。第三部分STAT3信号通路介导拉应力刺激下SOST对HODLCs成牙本质向分化的调控研究目的:研究拉应力刺激下SOST与Wnt/β-catenin信号通路、信号传导及转录激活蛋白3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）信号通路之间的关系,探索SOST调控HODLCs成牙本质向分化的下游信号通路机制。材料与方法:将HODLCs搭载FX-5000拉应力系统,加力24 h后用Western Blot技术检测磷酸化β-catenin蛋白、总β-catenin蛋白、磷酸化STAT3蛋白、总STAT3蛋白的表达变化;慢病毒转染构建稳定过表达SOST的HODLCs,加力24小时后用Western Blot技术检测磷酸化STAT3蛋白和总STAT3蛋白的表达变化;将稳定过表达SOST的HODLCs用STAT3抑制剂Stattic预处理1 h,随后加力24 h,用q PCR及Western Blot技术检测SOST、DSPP、OPN、OCN、Runx2的表达变化。实验结果:拉应力刺激下,HODLCs中Wnt/β-catenin信号通路及STAT3信号通路的活性都被抑制;过表达SOST增高了拉应力降低的STAT3信号通路活性;Stattic使被SOST过表达所抑制的DSPP、OPN、OCN、Runx2的表达量回升。结论:拉应力刺激下,SOST通过STAT3信号通路调控HODLCs的成牙本质向分化。总结:机械应力刺激下,ERK1/2通路与蛋白酶体途径介导了成牙本质样细胞中的SOST的表达下降,使STAT3通路活性降低从而促进成牙本质样细胞的成牙本质向分化。SOST通过负性调控成牙本质细胞的分化参与了机械应力作用下反应性牙本质的形成过程,可为非龋性硬化牙本质的形成提供一种新的可能的观点。