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研究背景:阿尔茨海默综合征（Alzheimer’s disease,AD）是最常见的进行性神经退行性疾病,主要表现为认知功能障碍,其病因及发病机制尚未完全清楚,目前尚无有效的治疗方法。AD主要病理特征是神经原纤维缠结（Neurofibrillary tangles,NFTs）、大量淀粉样蛋白β（amyloid-β,Aβ）沉积等。研究显示,肥胖是增加AD患病风险的重要诱因,大脑内高饱和游离脂肪酸水平所引起的脂毒性是增加患AD风险的关键因素之一,但大脑内脂毒性机制尚未完全阐明。丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶5（Mitogen-activated protein kinase phosphatase-5,MKP-5）是一种双特异性磷酸酶,在糖尿病、肺纤维化及癌症中发挥调节作用。有研究表明,MKP-5影响少突胶质细胞分化,对治疗髓磷脂沉积有关的疾病提供可能性,而髓磷脂异常与多种神经退行性疾病有关。但MKP-5在神经元损伤中的作用机制尚未见报道。本研究以棕榈酸（Palmitic acid,PA）建立PC12脂毒性细胞模型,通过观察细胞凋亡、内质网应激、氧化应激、炎症反应以及Aβ生成,探讨MKP-5对脂毒性相关神经元损伤的调控作用及可能机制。实验目的:通过调控PC12细胞中MKP-5表达,分析MKP-5对神经元脂毒性损伤过程的影响,并探讨其可能发生机制。实验方法:1.构建高脂饮食（High fat diet,HFD）小鼠模型,分离大脑皮质和海马,Western blot法检测MKP-5蛋白的表达量。2.用不同浓度PA（75、150、300、400、500μM）处理PC12细胞6 h,CCK-8法检测细胞增殖活力变化。PA（300μM）处理PC12细胞不同时间（0、1、3、6、9、12、18 h）,Western blot法检测凋亡指标（cleaved Caspase 3、cleaved Caspase9）的蛋白水平。3.用MKP-5 si RNA（si-MKP-5）和对照scramble si RNA（si-SC）转染PC12细胞36 h,再以PA（300μM）处理PC12细胞6 h。CCK-8法检测细胞增殖活力;Western blot检测细胞凋亡和内质网应激相关蛋白的表达;Real-time PCR检测淀粉样蛋白生成、神经炎性因子和氧化应激相关基因转录表达;分析细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）、丙二醛（Maloialdehyde,MDA）、总抗氧化能力（Total Antioxidant Capacity,T-AOC）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、超氧化物酶（Superoxide Dismutase,SOD）和谷胱甘肽（Glutathione,GSH）水平。4.用MKP-5过表达的逆转录病毒Retro-MKP-5及其对照病毒Retro-PLNCX2分别感染PC12细胞48 h,PA（300μM）处理6 h后,Western blot检测凋亡和内质网应激相关蛋白表达;Real-time PCR检测淀粉样蛋白生成、神经炎性细胞因子和氧化应激相关基因转录表达。实验结果:1.HFD上调小鼠大脑皮质部及海马中MKP-5的蛋白水平Western blot检测结果显示,与正常饮食组小鼠相比,HFD小鼠体重和血糖显著增高,大脑皮质部和海马中MKP-5蛋白表达显著升高。2.PA抑制PC12细胞增殖,诱导细胞凋亡CCK-8检测结果显示,PA处理后PC12细胞增殖活力呈剂量依赖性下降,在300μM PA处理下,细胞活力降低约50%。Western blot结果显示,凋亡相关cleaved Caspase 3和cleaved Caspase 9蛋白在PA处理6 h时表达量最高。3.干扰MKP-5表达抑制PA诱导的PC12细胞凋亡CCK-8结果显示,干扰MKP-5表达明显抑制PA诱导的细胞增殖活力下降。Western blot结果显示,干扰MKP-5表达显著抑制PA诱导的Caspase家族蛋白酶中凋亡效应酶Caspase 3的剪切活化。并且,下调MKP-5表达显著下调PA诱导的死亡受体凋亡途径相关蛋白cleaved Caspase 8和线粒体凋亡途径相关蛋白cleaved Caspase 9、Bax的表达。另外,MKP-5过表达后进一步促进PA诱导的Caspase 8、Caspase 3和Caspase 9的剪切活化,Bax进一步升高。结果表明干扰MKP-5表达可抑制PA诱导的死亡受体途径和线粒体途径细胞凋亡。4.干扰MKP-5表达缓解PA诱导的内质网应激Western blot结果显示,PA可显著上调IRE1、EIF2α蛋白的磷酸化水平,而下调MKP-5后可抑制PA诱导的上述蛋白的磷酸化。同时PA诱导内质网应激凋亡相关蛋白cleaved Caspase 12的表达,而干扰MKP-5表达可显著下调PA诱导的cleaved Caspase 12的高表达。MKP-5过表达后可进一步提高IRE-1α和EIF2α的磷酸化水平,促进Caspase 12的剪接活化和CHOP的表达,从而加剧PA诱导的PC12细胞内质网应激损伤。结果表明,沉默MKP-5具有抑制PA诱导的内质网应激的作用。5.干扰MKP-5表达抑制PA诱导的淀粉样蛋白生成和氧化应激Real-time PCR结果显示,PA可诱导Aβ生成相关基因APP和BACE1的表达,而抑制MKP-5表达显著下调APP和BACE1。MKP-5过表达可进一步上调APP和BACE1的转录水平。氧化应激分析结果显示,PA可诱导ROS生成增加,增加脂质过氧化产物MDA生成,抑制抗氧化酶SOD、CAT及非酶抗氧化物GSH水平,降低细胞T-AOC含量。而抑制MKP-5表达后,显著降低PA诱导的ROS生成,下调MDA水平,上调PC12细胞抗氧化能力。Real-time PCR结果显示,PA可提高p22phox和NOX-4的m RNA水平,而沉默MKP-5显著抑制PA对上述NADPH酶相关基因的刺激作用,同时MKP-5过表达加剧p22phox上调。结果表明,下调MKP-5表达可抑制细胞氧化应激反应。6.干扰MKP-5表达抑制PA诱导的炎症反应和STAT3磷酸化Real-time PCR证实,PA可以上调促炎细胞因子IL-6、IL-1β和i NOS的m RNA水平,MKP-5过表达后可进一步促进上述炎症因子的转录。而干扰MKP-5表达可显著抑制上述神经炎性因子的转录水平,抑制PA诱导的炎症反应。Western blot结果显示,PA上调STAT3磷酸化水平,但干扰MKP-5表达会抑制STAT3活化。MKP-5过表达则进一步加剧PA诱导的STAT3磷酸化水平增加。实验结论:抑制MKP-5表达缓解PA诱导的PC12细胞增殖抑制、内质网应激、氧化应激、细胞凋亡和神经元炎症,并减轻脂毒性相关的神经元Aβ沉积。