DBP和DEHP降解菌的分离鉴定与全基因组分析

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邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)和邻苯二甲酸二丁酯(Di-n-butyl phthalate,DBP)是邻苯二甲酸酯类化合物(Phthalic Aicd Easters,PAEs)中常见的塑料增塑剂,被大量地应用于建筑行业、家庭用品、医疗行业等。由于DBP和DEHP与塑料之间不存在共价键,很容易从塑料产品中脱离释放到环境中,如地表水、土壤以及大气等。为消除环境中DBP和DEHP,生物降解是目前广泛研究的方法之一。DBP和DEHP微生物降解的前期研究是关于降解菌的筛选驯化以及降解特性的分析,但对于降解功能基因的研究还不够深入,因此加大对降解菌分子基因层面的研究投入很有必要,基因库数据的丰富对以后不同菌的探究也具有一定的理论和现实意义。本研究从韶关市一处污染水渠边的植物体内分离得到一株能高效降解环境中DBP和DEHP的植物内生菌,经形态学鉴定、生理生化性质和16S rRNA基因同源性分析,初步鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。(1)以PAEs(DBP和DEHP)为降解底物,Bacillus subtilis的最适pH和温度分别为7.0和30℃。Bacillus subtilis在3-5 d内对50 mg/L的DBP降解率达90%以上,对DEHP的降解约为40%。(2)Bacillus subtilis先是作用于DEHP中的一个酯键,使其断裂形成邻苯二甲酸单-2-乙基己基酯(Monoethylhexyl phthalate,MEHP),随后继续水解酯键断裂形成邻苯二甲酸(Phthalic Aicd,PA),最后在一系列酶的共同作用下形成简单化合物CO2和H2O。(3)采用Illumina Hiseq第三代测序技术,对Bacillus subtilis完成了全基因组测序,共获得1473727800 bp大小的原始数据,平均测序深度为100×。利用SOAP denovo软件初步组装测序数据,利用blasR比对Pacbio数据进行纠错,再进行后续组装,获得了Bacillus subtilis菌株的全基因组完成图。(4)该Bacillus subtilis菌株的全基因组大小为4149636 bp,GC含量为43.70%,有一个CRISPs(成簇的规律间隔的短回文重复序列);同时Bacillus subtilis还包含了24个rRNA、81个tRNA和11个sRNA操纵子,25个基因岛,总长度为343635 bp;共有前噬菌体5个,平均长度为25100 bp,散在重复序列共有354个、串联重复序列共有70个。(5)对Bacillus subtilis全基因组序列进行扫描分析,得到4344个开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),分别与NR数据库、Swiss-Prot数据库、COG和GO数据库等比对,从而获得预测基因的功能注释。通过GO功能分析发现,Unigene中占主要的是催化功能、结合功能和转运活性;KEGG注释结果表明,Unigene富集路径主要集中在代谢途径、次级代谢产物的生物合成和不同环境中的微生物代谢。(6)结合基因的注释结果,预测了PAEs降解相关酶基因,具体有环裂解双加氧酶3个、羧基粘康酸内酯脱羧酶1个、脱羧酶3个、单加氧酶4个。通过以上研究为接下来的转录组测序提供了理论依据。同时为环境中DBP和DEHP的生物修复提供了新的研究方向。
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