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经济全球化和人口数量的急剧扩增,使我们对能源的需求越来越大,与此同时,石油等不可再生能源正面临枯竭,由此引发研究人员对可再生能源产生浓厚的研究兴趣。目前,生物柴油已被认为是最理想的可再生能源之一,其主要成分是脂肪酸甲酯(FAME),是以可再生资源为原料通过酯交换制备而成,具备与石化柴油相近的性能。微藻制备生物柴油因具有不占用耕地,易收易养,含油量高等特点而成为近年来的研究热点。利用基因工程可以实现定向、效果显著的改变物种性状的目的,是常用的改造基因的方法。在莱茵衣藻脂肪酸合成路径中,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH)和溶血磷脂酸酰基转移酶(Lyso-Phosphatidic Acid Acyltransferase,LPAAT)是三酰甘油组装路径上的催化酶,在调控脂肪酸含量方面具有重要作用。本研究分别将活性较高的外源基因,即油菜(Brassica napus)溶血磷脂酸酰基转移酶基因(lpaat)和酵母(Saccharomyces cerevisiae)的甘油3-磷酸酰基转移酶基因(gpd1)转入莱茵衣藻CC-849基因组中并进行表达,进而改变莱茵衣藻脂肪酸的含量。具体研究结果如下:1、从NCBI上获得lpaat和gpd1基因的表达序列,根据莱茵衣藻密码子优先性进行改造得到c-lpaat和c-gpd1基因,经人工合成获得改造好的基因序列,再连接到p H124载体中,构建衣藻表达载体p H124-c-lpaat和p H124-c-gpd1,通过珠磨法转化到莱茵衣藻中,经过抗性筛选、PCR检测和GC-MS分析,最终筛选得到高效表达目的基因的转基因藻株,成功转入c-lpaat基因的转化子有Tranc-lpaat-J、K、L、M、N、Q、1、2、3、4、5、14、15,成功转入c-gpd1基因的转化子有Tranc-gpd1-P、T、C、O、N、10、15、16;2、利用RT-PCR、荧光定量PCR等技术对转基因藻中c-lpaat和c-gpd1基因的表达情况进行分析。半定量RT-PCR结果显示Tranc-lpaat-15和Tranc-gpd1-T的目的基因表达水平最高,进一步的荧光定量PCR结果表明:在热激诱导的条件下,外源基因c-lpaat和c-gpd1表达量明显上升,热激一次后c-lpaat基因表达量上升了1.93倍,c-gpd1基因表达量上升了2.98倍。连续热激三次后,c-lpaat基因表达量分别为原来的3.01倍,4.46倍和5.30倍;c-gpd1基因的表达量分别为原来的3.6倍,5.42倍和8.58倍;3、利用GC-MS分析转基因藻的总脂肪酸含量及组分,得到结果如下:(1)对所挑选的转化子进行筛选,分别获得脂肪酸含量最高的转化株,即含有c-lpaat基因的Tranc-lpaat-15和c-gpd1基因的Tranc-gpd1-T转化子;(2)在热激一次后,转基因藻Tranc-lpaat-15的脂肪酸含量提高了16.8%,其中提高最多的是C18:1t,较对照组增加了177.27%;转基因藻Tranc-gpd1-T脂肪酸含量提高了26.7%,其中提高最多的是C18:1t,较对照组增加了270.91%;(3)连续热激三次后,转基因藻Tranc-lpaat-15脂肪酸含量提高了44.5%,其中提高最多的是C18:0,C18:1t,较对照组提高了355.29%和220.11%。转基因藻Tranc-gpd1-T脂肪酸含量提高了67.5%,其中提高最多的是C18:0,C18:1t,较对照组提高了428.24%和394.18%。在转基因藻Tranc-lpaat-15和Tranc-gpd1-T中,C16:0,C18:0,C18:1t、C18:2t的含量提高最多。通过遗传重组的方法将促进油脂合成的外源基因导入莱茵衣藻核基因组,经整合后可获得性状能稳定遗传的转基因藻株。本研究转入酶活性较高的外源基因lpaat和gpd1,采用可诱导的热休克蛋白启动子表达目的基因,实现目的基因的可控表达,最终调控三酰甘油TAG的合成代谢,使藻细胞的油脂含量增加,以上研究为获得油脂含量高的转基因藻株用于生物柴油的生产奠定实验基础。