【摘 要】
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肝癌是一种最常见的恶性肿瘤,一直没有很好的治疗方法,目前倾向于化疗、基因治疗等多种方法联合治疗,Kim等用TRAP法检测发现肝细胞中不表达端粒酶活性,而肝癌细胞中则有很高
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肝癌是一种最常见的恶性肿瘤,一直没有很好的治疗方法,目前倾向于化疗、基因治疗等多种方法联合治疗,Kim等用TRAP法检测发现肝细胞中不表达端粒酶活性,而肝癌细胞中则有很高的表达,这从一定程度上表明端粒酶可以作为靶点用于肝癌的诊断和治疗。 端粒是真核细胞线性染色体末端的结构,对染色体末端起保护作用,端粒的长度与端粒酶活性有关,人类端粒酶由具有催化活性的亚单位(hTERT)、端粒酶模板RNA(hTR)和端粒结合蛋白(hTEP-1)组成,其中hTERT和hTR为端粒酶功能所必需。 本文通过RNA干扰技术特异下调端粒酶亚单位hTR和hTERT基因的表达,研究了siRNA下调的效果以及下调以后对端粒酶活性以及肝癌细胞增殖和凋亡的影响,探讨了控制人肝癌细胞端粒酶活性的可能性,并为将端粒酶作为抗肝癌新药靶点提供了初步的实验依据。 针对hTERT基因设计并化学合成了三对siRNA。另设计了两对siRNA,并通过PCR扩增法获得其DNA表达模板,然后将其亚克隆入pEGFP载体中。同时针对hTR基因设计了三对siRNA,并用同样的方法将其模板亚克隆入pEGFP载体中。用脂质体转染法将siRNA转染入人肝癌细胞株Bel-7404细胞中,直接合成和载体表达的siRNA分别以oligofectamin和lipofectamin2000脂质体进行转染;荧光显微镜检测siRNA表达载体转染细胞的效率;G-418选择培养基筛选稳定表达载体siRNA的细胞株;转染siRNA适当天数后以Trizol试剂抽提细胞总RNA,RT-PCR检测基因表达变化,端粒末端重复序列扩增(TRAP)法检测端粒酶活性变化,流式细胞仪检测细胞凋亡;Real-time PCR检测PEG10基因表达与hTERT基因表达的影响。 针对hTERT和hTR基因设计的一共八对siRNA均能不同程度的特异下调基因的表达,其中载体表达的siRNA在24小时抑制效率最高,而直接
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