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鱼类属于变温的脊椎动物,具有一些非常独特的免疫因子和免疫机制。鱼类同时具有PKR和PKZ基因,它们串联存在于基因组当中。在细胞中,PKR是一种双链RNA受体,而PKZ是一种Z-DNA/Z-RNA受体,PKR与PKZ均属于干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs),它们都能对病毒侵染产生应答并阻碍细胞蛋白质的合成。干扰素调节因子(Interferon Regulatory Factor,IRF)是一类参与机体内I型干扰素(IFN)及干扰素刺激基因(ISG)转录调控的转录调节因子家族。IRF3和IRF7属于IRF家族成员,是调节IFN和ISG表达的关键因子。IRF3和IRF7在宿主细胞抵抗病毒侵入,调节细胞生长和免疫应答反应中都扮演着十分重要的角色。首先,我们通过检测了病毒感染诱导后CiPKR和CiPKZ的mRNA表达水平来分析CiPKR和Ci PKZ基因的应激表达情况。RT-PCR数据分析显示CiPKR和CiPKZ在CIK细胞经Poly I:C处理不同时间后的表达情况。其中PKR经poly I:C刺激3小时后上调,在刺激6小时后达到最高峰(表达水平为对照组0 h的5倍),随后在48小时逐渐恢复0小时水平;而PKZ的表达从3小时到24小时内逐渐上调,刺激24小时后达到峰值(表达水平为0小时的29.3倍),然后在48小时表达量逐渐下降并恢复到0小时的水平。表明CiPKR和CiPKZ均参与了细胞的抗病毒免疫应答反应。对实验室前期克隆的Ci PKR(KJ704845)和CiPKZ(KJ704844)启动子序列进行了预测分析发现CiPKR启动子含有2个ISRE元件,CiPKZ含有1个ISRE元件。说明他们的启动子均有与IRF结合的元件。为研究CiIRF3和CiIRF7分别与草鱼PKR和PKZ启动子的亲和性,我们根据草鱼PKR和PKZ启动子序列获得了野生型PKR和PKZ启动子以及删除了ISRE元件的PKR-nISRE和PKZ-nISRE突变启动子。并构建了含有IRF3开放阅读框全长和IRF7开放阅读框全长的原核表达载体(pET32a),并通过Ni亲和层析纯化获得IRF3和IRF7目的蛋白。琼脂糖凝胶阻滞实验分析结果表明,纯化的Ci IRF3和CiIRF7蛋白均能与PKR和PKZ的启动子核酸序列有较强的亲和性,而与PKR和PKZ突变启动子的亲和性较低。随后,构建了不同的启动子质粒(pGL3-PKR-luc和pGL3-PKZ-luc)和真核表达载体质粒(pcDNA3.1-IRF3和pcDNA3.1-IRF7)分别在CIK细胞中进行瞬时共转染实验。实验分析结果表明:在CIK中,CiIRF3和CiIRF7均可以上调草鱼PKR与PKZ启动子的转录活性。我们猜想CiIRF3和CiIRF7可能是通过结合PKR和PKZ启动子上的ISRE元件进行调控的。为了更深入的分析研究ISRE元件对草鱼PKR和PKZ基因转录调控的影响,我们将草鱼PKR和PKZ启动子序列上预测到的ISRE元件去除掉,构建突变的启动子荧光素酶报告基因载体质粒(pGL3-PKR-nISRE-luc和pGL3-PKZ-nISRE-luc),随后将pcDNA3.1-IRF3和pcDNA3.1-IRF7分别与pGL3-PKR、pGL3-PKZ、pGL3-PKR-nISRE和pGL3-PKZ-nISRE质粒进行瞬时共转染于CIK细胞中。结果显示ISRE元件的去除使PKR和PKZ基因的转录活性明显降低。这说明ISRE是CiPKR和Ci PKZ转录起始的一个重要调控元件,且IRF3和IRF7在ISG转录调控和非依赖性IFN途径中是非常重要的调节因子。