第一部分Ⅱ型胶原诱导型RA大鼠模型（CIA）的建立及评价目的:建立Ⅱ型胶原诱导型大鼠关节炎模型（Collagen type Ⅱ-induced arthritis,CIA）,并对该动物模型进行评价,探讨P2X7受体（P2X7R）在CIA大鼠体内的表达。方法:选择20只雌性SD大鼠随机分成空白对照组、模型对照组,每组10只。使用牛Ⅱ型胶原在等体积的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂中乳化制作成浓度为1 mg/mL含胶原的稳定的完全乳化剂。固定大鼠,足趾部位皮下缓慢注射0.1 mL Ⅱ型胶原乳化剂,避免乳化剂注射进血管或更深层,并于1周后在尾根部多点加强注射,诱导建立CIA大鼠模型,空白对照组在相同部位注射等量的生理盐水。比较空白对照组与模型组大鼠外观形态变化、受累关节的肿胀程度、关节炎评分和体内炎性因子的表达（TNF-α、IL-6、IL-1β）,以及进行受累关节影像学检查和造模后关节滑膜及软骨组织的病理检查等评定CIA模型是否构建成功。结果:牛Ⅱ型胶原在等体积的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂中乳化制作诱导溶剂,用乳化剂于大鼠皮下注射及尾根部多次增强免疫注射。大鼠接受免疫注射的当天观察到下肢肿胀,逐渐出现关节红肿,1-2周左右关节红肿明显,甚至出现局部皮肤破溃、坏死等现象,随着时间推移出现关节肿胀畸形、活动受限,肿胀度趋于平缓。与空白对照组相比,模型组的大鼠进食及活动均明显减少,毛发色泽差,体重增长缓慢。模型组大鼠与对照组比较,关节炎指数评分明显升高,血清炎性因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）、关节滑膜及软骨组织P2X7R的表达均升高,且差异有统计学意义（p＜0.05）。X片可见模型组大鼠关节明显软组织肿胀影,关节间隙狭窄,局部骨密度不均匀。HE染色可见模型组关节滑膜增生肥厚,周围可见大量的炎性细胞浸润,血管翳形成。番红-固绿染色可见模型组大鼠关节软骨及骨破坏明显,连续性消失,关节结构紊乱。结论:采用Ⅱ型胶原诱导建立了 CIA大鼠模型,观察模型组大鼠的形态可见明显的关节红肿等炎症反应,与空白对照组比较,CIA大鼠模型关节炎指数明显升高,体内炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达升高。关节滑膜及软骨组织病理分析发现,模型组大鼠关节结构呈明显的炎症反应特点,与正常对照组相比,差异有统计学意义,表明CIA大鼠模型构建成功,且P2X7R在CIA大鼠体内明显高表达。第二部分P2X7R特异性拮抗剂A804598抑制CIA大鼠的炎症反应目的:通过给予CIA模型大鼠药物P2X7R特异性拮抗剂A804598,观察其对CIA大鼠炎症反应的治疗作用并探讨其可能的作用机制。方法:选择雌性SD大鼠30只,体重220±20 g左右,随机分成6组,即正常对照组、模型组、阳性对照组（地塞米松2.5 mg/Kg/d）、拮抗剂低剂量治疗组（10 mg/Kg/d）、拮抗剂中剂量治疗组（30 mg/Kg/d）、拮抗剂高剂量治疗组（50 mg/Kg/d）,每组5只。具体操作:空白对照组及模型对照组10天后腹腔注射生理盐水,CIA+地塞米松组于第10 d开始每天注射地塞米松2.5 mg/Kg,CIA+P2X7R 拮抗剂组第 10 d 开始各组每天注射 A804598 10 mg/Kg、30 mg/Kg、50 mg/Kg,连续注射28 d。注射后每天观察各组大鼠的关节肿胀程度和活动量等。采集各组大鼠给药前、给药后2周、4周的血清,ELISA检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β的表达水平并进行比较,测定各组大鼠血清中氧化应激反应标志物的含量,用RT-qPCR分析的方法检测关节滑膜、软骨P2X7R、MMP-1、MMP-9、MMP-13的mRNA量表达水平,最后进行大鼠关节病理组织学检测和免疫组化实验。结果:各组大鼠的表型观察中,空白对照组一般情况良好,关节无肿胀,活动自如;CIA模型组一般情况差,四肢关节红肿明显,活动受限;拮抗剂A804598低剂量组可见关节轻度肿胀,但较模型组红肿好转;DXM及拮抗剂A804598中、高剂量组大鼠一般情况良好,关节红肿基本消失,活动无明显受限。ELISA检测各组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,CIA模型组血清中促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的含量与空白对照组相比明显升高,与正常组相比分别升高了 3倍、3倍和2倍。给药DXM和P2X7受体拮抗剂A804598均能显著降低大鼠血清中上述炎性因子的含量,差异具有统计学意义（P＜0.05）,这些炎性因子的表达水平与A804598的治疗效果呈浓度依赖性。CIA模型组血清中氧化应激标志物NO、MDA和GSH的含量水平与空白对照相比显著升高,与正常组相比分别升高了 10倍、3倍和3倍,血清SOD明显降低,SOD和抑制羟基活性的含量与正常组相比降低了 1/3和1/5。给药DXM和拮抗剂A804598都显著降低大鼠血清中NO、MDA和GSH的含量,同时明显提高SOD水平和抑制羟基活性的含量,A804598的治疗效果呈浓度依赖性,差异具有统计学意义（P＜0.05）。热图分析显示给药2周后,TNF-α、IL-1β和IL-6均与氧化应激指标NO和GSH之间存在很强的正相关性,给药4周后,TNF-α和IL-1β与5个氧化应激指标之间均存在明显的正相关关系或负相关关系。CIA模型组大鼠关节滑膜中P2X7R和MMP-1、MMP-9、MMP-13的含量与空白对照组相比明显升高,分别升高了 3倍、3倍、4倍和5倍,给药DXM和A804598均能显著降低大鼠滑膜中这些指标的含量,差异具有统计学意义（P＜0.05）。与此一致,CIA模型组关节软骨中P2X7R和MMP-1、MMP-9、MMP-13的含量与空白对照组相比显著升高,分别升高了 4倍、4倍、6倍和5倍,给药DXM和A804598后均能显著的降低这些指标的表达,A804598的治疗效果呈浓度依赖性,差异具有统计学意义（P＜0.05）。病理切片HE染色结果显示空白对照大鼠的关节结构正常,无炎性细胞浸润;模型组大鼠关节结构紊乱,明显的炎性细胞浸润,滑膜细胞异常增生,局部可见“血管翳”形成,软骨表层变性、坏死,软骨面连续性消失;与模型组相比,给药A804598拮抗剂治疗组关节内炎性细胞浸润减少,关节滑膜组织的病理性增生肥厚有改善,软骨结构有恢复,A804598高浓度组关节组织病理改善较为明显。番红O-固绿染色进一步显示CIA模型组的关节结构紊乱,关节面破坏明显,软骨层结构模糊,给药拮抗剂处理后,关节组织结构恢复明显,软骨细胞增多。免疫组织化学染色结果进一步证实TNF-α、IL-1β和IL-6在CIA模型组关节滑膜组织的阳性表达与空白对照组相比明显增多,给药后TNF-α、IL-1β和IL-6的表达明显降低。半定量分析显示,拮抗剂A804598治疗组的炎性因子表达水平明显降低,炎性因子的表达水平与P2X7R拮抗剂呈浓度依赖性。结论:P2X7R在大鼠体内存在表达,在CIA大鼠体内mRNA水平表达显著升高。P2X7R拮抗作用可以显著降低CIA大鼠体内TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子的表达,调节体内氧化应激反应,以及降低大鼠关节滑膜和软骨中的MMP-1、MMP-9、MMP-13基质金属蛋白酶的表达,并能够恢复破坏关节的结构,减少炎症细胞浸润,保护关节,P2X7R的拮抗作用能够以剂量依赖性方式抑制CIA大鼠关节的炎症反应。第三部分P2X7R特异性拮抗剂A804598抑制人FLSs炎症反应的实验研究目的:探讨P2X7R在类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLSs）的表达,以及P2X7R特异性拮抗剂A804598对人FLSs炎症反应的作用和机制。方法:从正常人群（空白对照组,n=10）和RA患者（实验模型组,n=10）的膝关节滑膜组织中分离出正常的滑膜成纤维细胞（N-FLSs）和类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞（RA-FLSs）。取材的滑膜组织来自关节外科关节镜手术患者,并且术后病理学检查排除肿瘤、感染等非类风湿性关节炎疾病,临床诊断明确的类风湿性关节炎患者和正常患者。采用胰蛋白酶消化法培养滑膜成纤维细胞。RT-qPCR和Western blot法测定P2X7R在N-FLSs和RA-FLSs中mRNA和蛋白水平的表达。然后将 N-FLSs 暴露于 10 ng/mLTNF-α中 24 h,RT-qPCR 和 Western blot 分析 P2X7R的表达水平变化,明确TNF-α对P2X7R表达水平的影响。在N-FLSs暴露于10 ng/mLTNF-α中24h,然后在0、10μM和20 μM拮抗剂A804598情况下,试剂盒检测胞内ROS和GSH含量,RT-qPCR 与 ELISA测定 FLSs 中的IL-1β、IL-6 表达及 MMP-1、MMP-3 和 MMP-13 的表达,Western blot法测定FLSs中JAK1/STAT3的磷酸化水平。结果:以β-肌动蛋白作为对照,Western blot结果显示P2X7R在人FLSs中表达。以人Caco-2细胞为阳性对照,RT-qPCR和Western blot方法确定了 P2X7R在RA-FLSs中mRNA和蛋白水平都明显上调,RA-FLSs中P2X7R的mRNA表达是N-FLSs的4倍,P2X7R蛋白的表达是N-FLSs的3.75倍（P＜0.01）。RT-qPCR及Western blot分析结果显示,以β-肌动蛋白为对照,用5、10和20 ng/mL TNF-α刺激FLSs,P2X7R在mRNA和蛋白质水平上的表达分别升高2、3和4倍（P＜0.05）,TNF-α的诱导可以以剂量依赖的方式显著增加P2X7R的表达。FLSs用10 ng/mL TNF-α刺激24 h,细胞内的ROS增加4倍以上,GSH水平降低了大约一半,给药拮抗剂A804598,可以显著降低FLSs 中 ROS 含量并提高 GSH 水平。FLSs 用 10 ng/mL TNF-α刺激 24 h,IL-1β和 IL-6 在 mRNA水平的表达分别增加4.5倍和4.75倍,拮抗剂A804598可以显著改善TNF-α诱导对IL-1β和IL-6上调的影响。ELIS A检测结果显示10 ng/mL TNF-α刺激FLSs后,IL-1β和IL-6在蛋白质水平表达也增加了 4.5倍和4倍,同样给药A804598可以明显降低其表达。RT-qPCR分析结果所示,TNF-α可诱导FLSs中MMP-1、MMP-3和MMP-13在mRNA水平表达分别升高4.8倍、4.7倍和4.5倍,给药A804598进行治疗可显著将这三种MMP的表达恢复到大约2倍的基础水平。Western blot分析结果显示,TNF-α诱导明显提高了 JAK1和STAT3蛋白的磷酸化水平,约为基础水平的5倍,而JAK1和STAT3的总量保持不变,给药A804598治疗可以以剂量依赖性的方式改善TNF-α诱导的JAK1/STAT3磷酸化水平,高剂量A804598可将P-JAK1/STAT3降低到2倍的基础水平。结论:P2X7R在人FLSs中表达,在人RA-FLSs中其mRNA和蛋白的表达更为显著。P2X7R拮抗剂A804598能够调节TNF-α诱导FLSs中ROS和GSH的含量失衡,起到抗氧化应激的作用。同时A804598以剂量依赖性方式抑制TNF-α介导的IL-1β和IL-6的上调,并且A804598通过下调FLSs中TNF-α诱导的MMP-1、MMP-3和MMP-13的高表达来预防软骨的降解,并可以通过调节JAK1/STAT3信号通路来发挥缓解炎症的作用。这些结果提示P2X7R的拮抗作用可以抑制人FLSs的炎症反应,P2X7受体可以作为治疗和预防类风湿关节炎新的靶点,值得进一步探讨和研究。