背景肝细胞性肝癌(HCC)是肝脏最常见的原发恶性肿瘤,具有较高的发病率和致死率。由于其容易转移复发的特点,HCC患者常表现为预后不良。因此,我们需要进一步研究肝细胞性肝癌的分子生物学机制,为其诊断和治疗提供新的策略。含I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(ADAMTS5),与基质金属蛋白酶(MMP)和解聚蛋白样金属蛋白酶(ADAM)同属Zn2+依赖的金属蛋白酶家族。其异常表达在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。关于其蛋白结构的研究显示,ADAMTS5除具有蛋白聚糖酶的活性外,更具有抗血管生成的作用。因此研究ADAMTS5在HCC中的表达及其作用机制具有重要意义。rs2830585是位于编码ADAMTS5的TSP重复序列1(TSR1)结构域的基因序列中的非同义单核苷酸多态性位点(nsSNP),SNPs3D软件预测结果显示rs2830585可通过改变蛋白质的氨基酸序列从而影响ADAMTS5的功能,而TSR1结构域是ADAMTS5发挥抗血管生成活性的关键。因此,对于以丰富肿瘤血管生成为重要特征的的肝细胞性肝癌,研究ADAMTS5 rs2830585单核苷酸多态性与肝细胞性肝癌肿瘤易感性之间的关系具有重要意义。目的1、检测ADAMTS5在肝细胞性肝癌中的表达情况及其与临床病理因素之间的关系。2、阐明ADAMTS5在肝细胞性肝癌发生、发展中的作用机制。3、明确ADAMTS5 rs2830585单核苷酸多态性与肝细胞性肝癌肿瘤易感性之间的关系。方法第一部分ADAMTS5在肝细胞性肝癌中的表达及其意义1、采用肝细胞性肝癌组织芯片及免疫组化,检测肝细胞性肝癌组织中ADAMTS5、血管内皮生长因子(VEGF)、CD34的表达。2、采用McNemar检验比较ADAMTS5在肝细胞性肝癌癌组织及癌周正常组织的表达差异。3、采用卡方检验或fisher精确概率检验比较adamts5的表达与临床病理因素之间的相关性。4、采用spearman等级相关系数比较adamts5、vegf、微血管密度(mvd)和肿瘤体积的相关性。5、采用生存分析比较adamts5的表达与患者总生存时间的关系。6、采用westernblot检测adamts5在正常肝细胞系与不同hcc细胞系中的表达。第二部分adamts5在血管形成中的作用及其机制1、通过构建高表达adamts5的肝细胞性肝癌细胞系及酶联免疫吸附测定法(elisa),确定肝细胞性肝癌中adamts5的表达对vegf分泌的影响。2、通过huvec细胞迁移和管状形成实验,检测肝细胞性肝癌细胞条件培养基对huvec细胞迁移和管状形成的影响。3、通过移植物成瘤实验,进一步在体内确定adamts5对肝细胞性肝癌肿瘤生长及血管生成的影响。第三部分adamts5单核苷酸多态性与中国汉族人群肝细胞癌易感性的研究1、收集220例肝细胞性肝癌患者和220例非肝细胞性肝癌对照患者临床资料,并进行随访。2、经知情同意,提取患者外周血dna,针对rs2830585单核苷酸多态性位点进行进行基因测序。3、使用spss19.0统计学软件进行统计学分析。结果第一部分adamts5在肝细胞性肝癌中的表达及其意义1、adamts5在肝细胞性肝癌癌组织中的表达显著低于癌周正常肝组织(mcnemar检验,p<0.05)2、adamts5的表达与肿瘤分期显著相关(p<0.01)。3、肝细胞性肝癌组织中adamts5的表达与mvd(r=-0.530,p<0.001)、vegf(r=-0.640,p<0.001)及肿瘤体积(r=-0.361,p<0.05)显著负相关。4、adamts5阳性表达肝细胞性肝癌患者总生存时间显著优于阴性表达adamts5患者(29.56versus12.96,p<0.001),adamts5可作为独立的预后因子预测肝细胞性肝癌患者的总生存时间(p<0.05)。5、ADAMTS5在正常肝细胞系L02中的表达高于肝细胞性肝癌细胞系。第二部分ADAMTS5在血管形成中的作用及其机制1、高表达ADAMTS5肝细胞性肝癌细胞条件培养基中VEGF的表达显著低于其对照组细胞条件培养基(p<0.001)。2、与对照组细胞条件培养基相比较,高表达ADAMTS5肝细胞性肝癌细胞条件培养基可显著抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移和管状形成能力(p<0.01),并且人重组VEGF可以从很大程度上恢复HUVEC细胞被抑制的迁移和管状形成能力(p<0.01)。3、高表达ADAMTS5肝细胞性肝癌细胞裸鼠移植瘤生长受到显著抑制(p<0.01),免疫组化结果显示ADAMTS5在裸鼠移植瘤中的高表达抑制了肿瘤内的血管形成和VEGF表达。第三部分ADAMTS5单核苷酸多态性与中国汉族人群肝细胞癌易感性的研究1、Logistic回归分析结果显示,与rs2830585 G等位基因相比,A等位基因显著降低肝细胞性肝癌发生风险(adjusted OR,0.348;95%CI 0.236-0.512;P<0.001);携带rs2830585 GA基因型的个体发生肝细胞性肝癌风险显著低于GG基因型携带者(adjusted OR,0.339;95%CI,0.044-11.535;P<0.001)。2、分层分析结果显示,rs2830585基因型与分层因素之间不存在显著交互作用。3、相关性分析结果显示,rs2830585基因型与肝细胞性肝癌临床病理因素间不存在显著相关性。结论1、ADAMTS5在肝细胞性肝癌中表达下调,其高表达与肝细胞性肝癌患者的良好预后相关。2、ADAMTS5通过减少肝细胞性肝癌中VEGF的分泌,抑制肿瘤血管生成及生长。3、ADAMTS5 rs2830585与肝细胞性肝癌的易感性显著相关,其突变型等位基因A显著降低肝细胞性肝癌的发病风险。