癌症，又名恶性肿瘤，目前为危害人类健康最重要的疾病之一。对于恶性肿瘤，迄今为止世界各国医学界仍无有效的治愈手段。虽然近年出现的免疫治疗、基因治疗、传统的中医中药治疗等不断发展，但以手术、放疗和化疗为主的传统方法仍为当前治疗癌症的三大重要手段。然而这些方法都分别有其各自的局限性。由于手术治疗具有创伤大，治愈率差，易发生转移等缺陷，而放化疗也常常使患者出现恶心、呕吐、局部组织放射性损伤、全身白细胞减少、免疫力低下等毒副反应症状。因此，研究毒性低、肿瘤选择性强的新一代的抗肿瘤药物是肿瘤治疗急需解决的课题和新方向，具有应用于肿瘤临床治疗的实际应用价值。CMT-3（Chemically modified tetracyclines-3）为四环素（广谱抗菌素）类衍生物，或称为4-去二甲基氨基山环素。从化学结构上来讲，CMT-3是将四环素去除了二甲氨基，甲基和羟基的功能基团。因此，其抗菌的功能被去除，但是却保留了抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的功能。由于基质金属蛋白酶（MMPs）与肿瘤的增殖和转移密切相关，已有的研究成果表明，CMT-3在抑制人乳腺癌、宫颈癌、肺癌、前列腺癌的增殖和转移中均具有明显的作用，提示其可作为一种广谱抗肿瘤新药。目前除了体内外实验的研究，CMT-3已被深入到临床试验研究的阶段。然而，通过文献检索发现，目前对于CMT-3在抗癌作用方面缺乏全面系统的研究，并且其抗癌机制也尚不明确，因此缺乏可靠的理论依据，限制了其临床应用。类似于临床使用的常规化疗药物，在临床试验的研究中，CMT-3也可使肿瘤患者产生明显的毒副作用（如头痛，恶心等）。丹参酮IIA磺酸钠注射液（TSN-SS）为一种丹参提取物，由于其对于心血管疾病具有较好的疗效而广泛用于临床。除此之外，目前也有研究表明，TSN-SS具有一定的抗癌以及化疗增敏作用。因此，本课题在深入探讨CMT-3抗癌效应和机制的同时，也首次将TSN-SS联合应用于CMT-3，旨在为肿瘤的临床治疗提供新型方案以及理论基础。本课题的研究内容共分为以下三个部分。第一部分CMT-3抑制癌细胞生长以及迁移能力的研究目的：研究CMT-3对不同p53状态癌细胞生长的影响，及其对宫颈癌HeLa细胞迁移能力的影响。以正常人乳腺细胞HBL-100，小鼠成纤维细胞L929和小鼠巨噬细胞Raw264.7作为对照，同时以顺铂、紫杉醇和吡柔比星常规化疗药作为对照，初步探讨其作用机制。方法：MTT法检测不同浓度CMT-3对乳腺癌MCF-7/MDA-MB-231、宫颈癌HeLa/Siha、肺癌NCI-H1975/NCI-H446等细胞的生存率的影响；MTT法检测同一浓度CMT-3、顺铂、紫杉醇和吡柔比星对乳腺癌MCF-7、宫颈癌HeLa和肝癌HepG2细胞生存率的影响；采用克隆形成实验分析CMT-3及其联合p53抑制剂PTF-α对癌细胞增殖的影响；通过贴壁实验方法检测CMT-3处理后宫颈癌HeLa细胞的粘附能力的变化；采用划痕实验发检测CMT-3对宫颈癌HeLa细胞迁移能力的影响；通过Transwell法检测CMT-3对宫颈癌HeLa细胞侵袭能力的影响；Western Blot法测定p53以及侵袭转移相关蛋白的表达；明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶的活性。结果：（1）CMT-3能明显抑制乳腺癌MCF-7/MDA-MB-231、宫颈癌HeLa/Siha、肺癌NCI-H1975/NCI-H446等细胞的生长，并呈时间依赖和浓度依赖关系；（2）癌细胞对CMT-3的敏感性具有组织类型之间的差异，其中肺癌细胞株对CMT-3较不敏感，而乳腺癌、肝癌细胞株相对较敏感；（3）癌细胞对CMT-3的敏感性与p53状态相关，同一组织类型的癌细胞中，p53野生型细胞株相对p53突变型细胞更为敏感；（4）与临床使用的常规化疗药相比较，CMT-3对于宫颈癌HepG2和宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用优于顺铂和吡柔比星，对于乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用甚至优于紫杉醇；（5）CMT-3能明显抑制乳腺癌MCF-7细胞和肝癌HepG2细胞的增殖，联合PTF-α却减弱了CMT-3抑制癌细胞增殖的能力，可能与p53蛋白表达的变化相关；（6）CMT-3可以抑制宫颈癌HeLa细胞的粘附、迁移及侵袭能力，呈时间依赖关系；（7）CMT-3能明显抑制MMP-2、MMP-9的表达和活性结论：（1）CMT-3具有抑制多种组织类型癌细胞生长和增殖的能力，其效果优于顺铂、吡柔比星和紫杉醇；（2）癌细胞对CMT-3的敏感性与组织类型和p53状态相关，其中乳腺癌、肝癌细胞株相对较敏感，p53野生型细胞株相对较敏感；（3）CMT-3抑制癌细胞生长和增殖的机制可能与p53蛋白表达的变化相关；（4）CMT-3可以抑制宫颈癌HeLa细胞的粘附、迁移及侵袭能力，其机制与抑制MMP-2、MMP-9的表达和活性相关。第二部分CMT-3抗宫颈癌作用及其机制的研究目的：研究CMT-3对宫颈癌Hela和Siha细胞形态、周期阻滞和凋亡等的影响。并且建立裸鼠宫颈癌异位移植瘤模型，观察CMT-3在动物体内对宫颈癌细胞生长的抑制作用。另外，观察CMT-3与X-线联合作用对于HeLa细胞的抑制作用。方法：采用活细胞工作站观察不同浓度和时间CMT-3作用后HeLa和Siha细胞形态的变化；MTT法检测CMT-3与Caspase-9联合使用后对HeLa细胞生存的影响；MTT法以及克隆形成实验检测CMT-3与X-线联合作用对于HeLa细胞的抑制作用；应用活性氧检测试剂盒测定CMT-3处理后HeLa细胞中ROS（Reactiveoxygen species）的变化；通过流式细胞术分析CMT-3作用后细胞周期的变化；Annexin V和PI双染法检测CMT-3及其联合ROS抑制剂NAC诱导宫颈癌细胞发生凋亡的情况；免疫荧光法分析CMT-3处理后Siha细胞NF-κB的分布；PCR法检测CMT-3处理后Siha细胞Cyclin E的转录情况；Western Blot法测定CMT-3对宫颈癌细胞凋亡相关蛋白的表达的影响。建立Babl/C裸鼠臀部HeLa细胞移植瘤模型，按处理因素分组，分别为生理盐水对照组；空载体组（1%羧甲基纤维素钠/载体脂质纳米粒，1次/4天，ig/ip）；顺铂阳性对照组（5mg/kg，1次/周，ip）；CMT-3口服给药组（溶剂：1%羧甲基纤维素钠，20mg/kg，1次/4天，ig）和CMT-3注射给药组（载体：脂质纳米粒，6mg/kg，1次/4天，ip）。连续给药治疗28天，期间观察动物一般生命体征的改变和肿瘤体积的变化，采用透射电镜检测肿瘤组织中超微结构的改变。结果：（1）CMT-3能促进宫颈癌HeLa细胞皱缩变圆，发生凋亡式的细胞形态改变，但是相同处理条件下CMT-3并不引起Siha细胞的形态发生类似改变；（2）相比于X-线单独照射组，CMT-3与X-线联合作用对于HeLa细胞的生长无明显影响；（3）CMT-3能够增加HeLa细胞内ROS的水平，并诱导细胞凋亡的产生，而NAC却明显抑制了该效应的发生；（4）CMT-3促进HeLa细胞内LC3-I及LC3-II的表达；（5）CMT-3促进Siha细胞阻滞于G0/G1期，却不引起其发生凋亡；（6）CMT-3能明显上调HeLa细胞内凋亡相关蛋白的表达水平（cleaved-caspase-9，cleaved-caspase-3，cleaved-PARP），下调pro-caspase-9，caspase-3，PARP以及凋亡抑制蛋白Bcl-2和NF-κB的表达；（7）CMT-3可以抑制Siha细胞周期相关蛋白CyclinE的表达而不影响其转录，并且诱导NF-κB由胞浆向胞核转位；（8）CMT-3在口服给药剂量下（20mg/kg）对荷瘤裸鼠产生一定的毒副作用，引起裸鼠体重发生下降，并且出现轻度焦虑反应，而注射给药剂量（6mg/kg）无明显的毒副作用；（9）CMT-3能明显抑制宫颈癌HeLa细胞移植肿瘤的生长，这种抑制作用优于传统化疗药物顺铂；（10）CMT-3能诱导移植瘤组织发生凋亡和自噬。结论：（1）CMT-3能在体内外抑制宫颈癌细胞的生长，HeLa细胞对于CMT-3的敏感性高于Siha细胞；（2）CMT-3在HeLa细胞中并不具有放疗增敏作用；（3）CMT-3能在体内外诱导HeLa细胞发生凋亡，其机制与ROS引起的内源性线粒体凋亡通路相关；（4）CMT-3能在体内外诱导HeLa细胞发生自噬；（5）而Siha细胞对CMT-3相对不敏感，可能与NF-κB由胞浆向胞核转位，进而抑制Cyclin E的表达，诱导细胞发生G0/G1期阻滞相关；（6）脂质纳米粒载体能增加CMT-3的水溶性，同时也降低了用药剂量，提高了CMT-3对于HeLa细胞移植瘤的疗效。第三部分CMT-3联合TSN-SS诱导自噬以及HMGB1释放效应的研究目的：研究CMT-3诱导肝癌HepG2细胞自噬以及HMGB1释放效应，检测其联合TSN-SS抑制肝癌HepG2细胞生长，并且探讨相关的作用机制。方法：Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3以及HMGB1的表达情况；免疫荧光法检测HMGB1定位的变化；建立GFP-LC3转染的HepG2细胞稳定株，通过荧光显微镜观察自噬体的产生；MTT法检测CMT-3及其联合TSN-SS处理后对HepG2细胞生长的抑制作用；。结果：（1）CMT-3能诱导HepG2细胞内LC3-I和LC3-II的表达增加，联合自噬抑制剂BafA1进一步增加了LC3-II表达的增加；（2）CMT-3能诱导HMGB1由胞浆向胞核最终向细胞外液释放；（3）与CMT-3单独处理组相比CMT-3与自噬抑制剂联合使用能增加细胞浆中HMGB1的表达；（4）相比于CMT-3单独处理组，CMT-3联合TSN-SS能够明显抑制HepG2细胞的生长；（5）CMT-3联合TSN-SS处理后，HepG2细胞内自噬体的形成以及自噬相关蛋白的表达明显增加；（6）联合TSN-SS处理明显抑制了CMT-3诱导的HepG2细胞内HMGB1的释放效应。结论：（1）CMT-3能诱导HepG2细胞内自噬的发生以及促进HMGB1的释放；（2）CMT-3所诱导的自噬与释放入胞浆的HMGB1之间存在相互影响，自噬有可能为细胞浆中HMGB1降解的途径之一；（3）TSN-SS能明显增加CMT-3所诱导的细胞毒性作用，这与抑制HMGB1由胞核向胞浆的释放，却增加了细胞内的自噬水平相关。