目的:血管内皮修复和血管新生的细胞学材料为内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)和内皮细胞。主要通过体内外实验研究高糖环境诱发氧化应激反应是否影响内皮祖细移植治疗糖尿病后肢缺血效果,探讨氧化应激反应如何引起wnt/β-catenin信号通路失衡,进而导致EPCs移植疗效受限。方法:体外实验:快速处死大鼠,收集下肢骨髓腔中细胞(MNCs),采用Ficoll密度梯度离心法、贴壁培养法分离和培养内皮祖细,使用连续形态观察、鉴定EPCs;使用分子探针经流式细胞仪检测(DCFH-DA)检测正常糖浓度(N=)处理后EPCs的氧化应激水平变化;据不同方法分为7组:N、HG、HG+DMSO(XAV-939溶剂)、DM+Licl(β-catenin的激活剂)、HG+tempol(氧化应激抑制剂)、HG+H2O2、HG+tempol+XAV-939(β-catenin的抑制剂)处理EPCs后,使用结晶紫法检测EPCs黏附TNFa预处理HUVEC的的细胞数量,使用免疫蛋白印迹法检测其wnt/β-catenin信号通路重要相关蛋白T-β-catenin(总β-catenin)、NP-β-catenin(非磷酸化-β-catenin)以及介导的相关黏附功能蛋白VCAM-1表达的情况。体内实验:链脲佐菌素腹腔打(STZ)针构建糖尿病大鼠模型,持续监测血糖2月,建立糖尿病动物模型,使之进食高脂饲料,手术显微镜下行左侧股动脉及其大分支结扎离断术以建立糖尿病单侧后肢缺血模型,并观察未进行EPCs移植情况下,血流恢复情况,以判断是否造模成功。将健康、同窝大鼠后肢骨髓中单核细胞经上述方法分离、培养出EPCs,术后24小时内按107/100g量经尾静脉移植入大鼠动物模型体内,在术前、术后(0d)、7d、14d、28d行连续LDPI检查以观察移植治疗效果。分为三组:健康大鼠后肢缺血模型经尾静脉注射生理盐水(h+ns)、糖尿病大鼠后肢缺血模型经尾静脉注射生理盐水(dm+ns)和糖尿病大鼠后肢缺血模型经尾静脉注射内皮祖细胞(dm+epcs),术后28天抽取外周血经分光光度仪检测氧化应激代谢产物mda和抗氧化指标sod水平。分为七组处理:h+ns、dm+ns,dm+epcs、dm+epcs+dmso、dm+epcs+tempol、dm+epcs+licl、dm+epcs+xav-939和dm+epcs+tempol+xav-939,经方法分离出来的epcs,经pkh-26标记示踪后,按107/100g量经尾静脉移注射入各组后肢缺血大鼠模型体内,在术前、术后(0d)、7、14、28行连续ldpi检查,并在术后28天取大鼠左后肢腓肠肌和外周血,采用elisa检测血清中wnt3a、wnt5a和wnt7a的量,并筛选可能的起作用调节因子;抽取外周血经分光光度检测氧化应激代谢产物mda和抗氧化指标sod水平;经ros分子探针dcfh-da和dhe在荧光显微镜下观察缺血腓肠肌中氧化应激水平;在荧光显微镜镜下观察缺血腓肠肌血管内皮标志物cd31示血管数量和pkh-26示踪的迁移、黏附细胞数量;使用westernblotting检测缺血腓肠肌wnt/β-catenin信号通路重要相关蛋白t-β-catenin(总β-catenin)、np-β-catenin(非磷酸化-β-catenin)以及介导的相关黏附功能蛋白vcam-1表达的情况。结果:经专用培养基egm-2培养观察:2d,培养的epcs为贴着培养孔板生长,呈圆形,少有呈椭圆形。7d,细胞增大、变为明显椭圆形或梭形生长;14d,观察可发现细胞出现“鹅卵石”样、漩涡样生长。通过激光共聚焦显微镜下见,细胞可见经过dii-ac-ldl处理后阳性的epcs为红色荧光,结合了fitc-uea-1后的epcs为黄色荧光,双染法阳性的细胞为正在分化的epcs。结扎左侧后肢的股动脉及其主要分支后经激光多普勒测定血流量比值,无论糖尿病体内,还是epcs处于高糖环境中,两者的活性氧产物都增加(p<0.05)。糖尿病组体内mda水平比健康大鼠体内mda水平高(p<0.05),且手术和移植epcs操作均对大鼠mda水平无影响(p>0.05);糖尿病大鼠与正常大鼠体内氧化相比应激水平增高,并导致抑缺血后肢血流恢复的受限,且能被氧化抑制剂所逆转。糖尿病体ROS增加的情况下,T-β-catenin、NP-β-catenin相对蛋白表量减少,特别是NP-β-catenin减少明显,与正常组比较具有统计学意义(P<0.01),进而通过Licl和XAV-939调节T-β-catenin、NP-β-catenin表达量,可以引起移植治疗血流恢复的改变:缺血后肢迁移的EPCs数量、新生血管数量和血流值大小与其表达量成正相关关系。血清中Wnt5a与糖尿病缺血下肢血流改善有密切关联,而wnt3a、wnt7a变化不符合血流恢复趋势。糖尿病体内wnt/β-catenin信号低下,引起VCAM1-1表达减少(P<0.05);而体外高糖处理EPCs后,wnt/β-catenin信号通路低下可能引起VCAM-1的降低(P<0.05),也许能导致EPCs黏附到缺血部位的能力减弱(P<0.05)。结论:(1)处于高糖环境的EPCs或糖尿病体内均存在高氧化应激水平,这能导致EPCs移植治疗糖尿病缺血后肢血流恢复受限;(2)EPCs中wnt/β-catenin信号通路受高氧化应激抑制引起VCAM-1表达量下降、黏附功能减,导致糖尿病缺血后肢血流恢受限;且wnt5a可能参与该调控过程。