生物技术类药物包括抗体、重组蛋白、核酸、多肽等药物是目前发展迅速及产业前景看好的医药产业。2010年全球生物药销售额达到1400亿美元,占全球药品市场的16%,其中有一半来自抗体产业的贡献。动物细胞培养技术作为现代生物医药产业的核心技术,近十年来随着抗体药物需求量的不断增加,以及越来越多的新产品进入临床研究,取得了前所未有的发展。如何快速高效地建立细胞生长高密度、产物表达高质高产的动物细胞培养过程及其产品生产工艺,不仅是各国大力发展抗体、重组蛋白质药物等生物技术制药产业的一项重要任务,而且也已成为国际生物医药产业创新和发展的核心竞争力。因此,研究动物细胞培养过程开发和优化的关键技术,建立抗体、重组蛋白质药物等生物医药产品的高效生产工艺,对发展我国生物医药产业、提高国际竞争力具有重要意义。本文将针对表达抗CD20单克隆抗体的DHFR-CHO细胞,研究培养过程中营养物代谢和副产物生成积累与细胞生长和产物表达的关系,并通过培养基组成和流加策略的设计和开发,深入认识以乳酸代谢为核心的细胞物质和能量代谢及其在细胞生长和产物表达中所发挥的重要作用,在此基础上设计开发经济高效的流加培养过程,以期对乳酸代谢实施有效的调控,提高细胞对营养物的利用效率并降低代谢副产物乳酸的生成,提升动物细胞培养过程的产能和经济性,从而为建立抗CD20单克隆抗体的工业化生产工艺奠定基础。本文首先通过典型的批式培养过程,考察了细胞生长、代谢及产物表达的基本特性。实验发现,批式培养过程的最高活细胞密度为3.6×106cells/ml,最终产物浓度为95mg/L。细胞代谢方面,当初始葡萄糖浓度在40mmol/L时,批式培养结束时葡萄糖尚未耗竭。但在整个批式培养过程中,被细胞消耗的葡萄糖中有58%以上转化为了代谢副产物乳酸,最高乳酸浓度累积至54mmol/L。谷氨酰胺在细胞生长结束时已经耗竭,此时最高氨浓度累积至3.3mmol/L。而其它氨基酸如天冬酰胺和半胱氨酸也在细胞生长结束时耗竭,这些营养物的缺乏可能影响细胞的生长和产物表达。此外,培养过程中各氨基酸的消耗和生成速率不一,现有培养基中氨基酸供给可能导致培养环境中的氨基酸浓度随着培养过程的进行而处于不平衡的状态,有可能影响细胞生长和产物表达。在上述批式培养基础上,通过对葡萄糖供给方式的研究,发现在培养过程中当以流加方式供给葡萄糖并控制其处于适中浓度时,细胞生长获得显著改善,且细胞对葡萄糖的利用率得到明显提高,从而减少了乳酸的生成和积累。进一步采用Plackett-Burman以及中心组合设计方法优化调整初始培养基中的氨基酸组成,获得了无血清无蛋白PFIA培养基,经生物反应器批式培养实验的验证,最高活细胞密度达到4.6×106cells/ml,最终产物浓度为180mg/L,较优化调整前显著提高,其效果也明显优于两种商业培养基,证明PFIA可作为后续流加培养过程的初始培养基。此外,基于top-down设计原则,通过考察流加培养基中各主要组分对细胞生长和产物表达的影响,初步确定了流加培养基FM-0中各组分的相对浓度。以流加方式供给葡萄糖,并采用初始培养基PFIA和流加培养基FM-0及相应流加策略,通过生物反应器的流加培养实验对初步开发的流加培养过程予以验证和评价,结果表明,流加培养过程中最高活细胞密度达到6.5×106cells/ml,最终抗体浓度达到270mg/L。但实验也发现,活细胞维持时间短和产物比生成速率低是该流加培养过程的主要不足。通过对营养物代谢的进一步分析发现,该流加培养过程中的营养物供给还不够均衡,大部分氨基酸在培养后期出现累积,同时乳酸出现大量生成和积累,渗透压也有显著提高。为进一步探明初步开发的流加培养过程存在的不足,并为后续进一步优化指明方向,实验单独考察了代谢副产物乳酸、氨以及渗透压对细胞生长和抗体产物表达的影响,并发现培养过程中乳酸的积累浓度达到并高于35mmol/L时将对细胞生长和产物表达造成非常明显的负面作用。生物反应器及相关实验验证的结果说明,在后续对流加培养工艺的进一步开发和优化过程中,首先需要对流加培养过程中以乳酸代谢为核心的细胞物质能量代谢进行研究、认识,并实现优化调控,以降低乳酸的生成,改善细胞培养环境,从而促进细胞生长、活性维持和抗体产物的表达。为此,本文继续深入研究了以乳酸代谢为核心的细胞物质与能量代谢,以及其与细胞生长和产物表达的关系,为后续流加培养过程中实现乳酸代谢的优化调控提供合理依据。实验首先根据葡萄糖浓度和碳源种类设计了四种实验条件,并考察了其相应的乳酸及丙酮酸代谢特性。进一步考察乳酸持续生成和乳酸先生成后消耗这两种典型特征下的细胞生长和产物表达特性、糖酵解以及氨基酸物质代谢及能量代谢情况。实验发现,在培养的中后期,伴随着乳酸由生成到消耗的代谢转变,细胞的物质与能量代谢效率相应获得提高,同时产物表达速率和细胞活性也获得了较好维持。此外,本文针对乳酸代谢由生成到消耗发生转变的实验条件,采用在起始点或者中途额外添加葡萄糖或丙酮酸这两种方式,进一步考察了葡萄糖、丙酮酸和乳酸三者之间的关系。实验发现,丙酮酸浓度在乳酸代谢特征发生转变的过程中发挥着核心作用,葡萄糖耗竭将导致丙酮酸的供给受限,从而引起乳酸代谢发生从生成到消耗的逆转,无法从葡萄糖获得足够的丙酮酸,是乳酸从生成到消耗发生代谢特征转变的先决条件。最后,本文基于对DHFR-CHO细胞乳酸代谢特性的认识,通过调整葡萄糖与半乳糖比例和流加的时间节点,设计优化了葡萄糖-半乳糖联合流加策略,并进一步对原流加培养基FM-0中的主要氨基酸和维生素组成进行了优化,建立了以调控乳酸代谢为核心的流加培养过程。该流加培养过程成功实现了对乳酸代谢的调控和较为均衡的营养供给,大幅延长了细胞的维持时间,其过程IVCC值达到64(109cells·day/L),较批式培养过程提高了170%,较初步开发的流加培养过程提高了45%；产物表达得到显著促进,其产物平均比生成速率达到14.8mg/(109cells·day),较批式培养过程提高了97%,较初步开发的流加培养过程提高了143%；最终抗CD20单克隆抗体浓度得到了大幅提高,终产物浓度达到了944mg/L,较批式培养提高了4.2倍,较初步开发的流加培养过程提高了2.5倍。通过本文的研究,建立了以调控乳酸代谢为核心的流加培养过程,为最终建立抗CD20单克隆抗体的工业化生产工艺奠定了基础。本文通过对动物细胞培养过程中乳酸代谢特性的研究,指出了乳酸代谢对过程所具有的重要意义,丰富并加深了人们对代谢副产物乳酸的认识,而本文中采用的流加培养过程的开发方法对其它抗体药物的生产过程开发和优化同样具有重要的借鉴意义。