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目的:斑蝥素(Cantharidin)是传统抗癌中药斑蝥的活性成分,并且是蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的选择性抑制剂。鉴于Cantharidin的抗癌作用,我们拟探讨Cantharidin在胰腺癌治疗中的应用价值。方法:通过MTT检测PP2A抑制剂Cantharidin和冈田酸(Okadaic acid,OA)对细胞增殖能力的影响;通过PP2A活性检测试剂盒检测Cantharidin对PP2A活性的抑制作用;通过平板克隆形成实验检测Cantharidin对胰腺癌细胞克隆形成能力的影响;通过流式细胞术检测Cantharidin对胰腺癌细胞细胞周期和凋亡的影响;通过Caspase活性检测试剂盒检测Cantharidin对外源性和内源性凋亡通路的激活作用;通过RT-PCR,Western blot检测Cantharidin对周期和凋亡相关基因表达的调控;通过流式细胞术检测Cantharidin诱导氧化应激的产生,并通过MTT检测Cantharidin诱导的氧化应激对胰腺癌细胞增殖能力的影响;通过划痕实验和transwell迁移实验检测Cantharidin对胰腺癌细胞迁移能力的影响;通过transwell侵袭实验检测Cantharidin对胰腺癌细胞侵袭能力的影响;通过RT-PCR检测Cantharidin对胰腺癌细胞基质金属蛋白酶-2(MMP-2)mRNA表达的影响;通过酶谱法检测Cantharidin对胰腺癌细胞MMP-2分泌量的影响。结果:Cantharidin可显著抑制胰腺癌细胞增殖能力,而对正常胰腺导管上皮细胞的毒性相对较弱。Cantharidin显著抑制PP2A活性,另一PP2A经典抑制剂OA也对胰腺癌细胞有显著抑制作用,提示Cantharidin对胰腺癌细胞的毒性作用可能是通过抑制PP2A活性。Cantharidin显著抑制细胞周期,呈G2/M期阻滞,并可诱导细胞凋亡。内源性和外源性凋亡通路均被激活。与G2/M期调控相关的CDK1表达下调,p21表达上调。促凋亡基因TNF-α, TRAILR1, TRAILR2, Bad, Bak和Bid表达增加,抗凋亡基因Bcl-2表达减少。Cantharidin可诱导显著的氧化应激,但Cantharidin所产生的氧化应激并不能抑制细胞生长。Cantharidin显著抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力,并显著抑制MMP-2表达和分泌。结论:研究结果显示Cantharidin对胰腺癌细胞的生长和转移具有显著的抑制作用,有望成为胰腺癌的有效治疗药物,PP2A有可能成为胰腺癌治疗靶点。目的:蛋白磷酸酶PP2A(protein phosphatase 2A)可以使诸多激酶去磷酸化而失活,由于激酶通路的激活通常会促进肿瘤细胞生长,因此PP2A被认为是抑癌因子,而PP2A抑制剂被认为是诱癌剂。然而,我们在第一部分研究中发现,PP2A抑制剂斑蝥素(Cantharidin)和冈田酸(Okadaic acid, OA)对胰腺癌细胞的生长有显著抑制作用,具体机制尚不清楚。IKK (IκB kinase)是NF-κB信号通路的上游激酶,PP2A可使IKK去磷酸化而失活,PP2A抑制剂可促进IKK磷酸化而激活NF-κB通路。激活NF-κB通路在某些情况下可诱导凋亡,因此,在本部分研究中,我们拟验证PP2A抑制剂对胰腺癌细胞的凋亡诱导作用是否是通过激活NF-κB通路。方法:通过MTT检测PP2A抑制剂对胰腺癌细胞活力的影响;通过流式细胞术检测PP2A抑制剂对胰腺癌细胞细胞凋亡的影响;通过RT-PCR和Western blot检测基因表达水平;通过Western blot和荧光素酶报告基因检测PP2A抑制剂对NF-κB通路的激活作用;通过Caspase活性检测试剂盒检测PP2A抑制剂对外源性和内源性凋亡通路的激活作用。结果:PP2A抑制剂Cantharidin和OA可导致IKKα持续磷酸化、IκBα磷酸化和降解,以及p65入核,提示PP2A抑制剂可激活胰腺癌细胞NF-?B通路。分别用DN-IKKα(IKKα显性负性突变体)、DN-IκBα(IκBα显性负性突变体)、Bay 11-7082(IκBα磷酸化抑制剂)、p65-shRNA阻断NF-?B通路,削弱了PP2A抑制剂对胰腺癌细胞活力的抑制作用,说明PP2A抑制剂抑制胰腺癌细胞活力是通过NF-?B通路依赖性途径。进一步我们研究发现,PP2A抑制剂通过激活NF-?B通路诱导了胰腺癌细胞通过外源性凋亡途径凋亡。同时PP2A抑制剂通过激活NF-?B通路选择性地促进了参与外源性凋亡途径的下游基因TNF-α, TRAILR1、TRAILR2的表达。另外,我们发现虽然PP2A抑制剂导致的NF-κB通路的持续激活可诱导胰腺癌细胞凋亡,NF-κB通路的基础活性却对维持细胞生存有重要作用,抑制NF-κB通路的基础活性也可诱导胰腺癌细胞凋亡。结论:PP2A抑制剂通过NF-κB通路依赖性途径诱导胰腺癌细胞凋亡。PP2A是潜在的胰腺癌治疗靶点。