人血清蛋白质印迹冰胶材料合成与应用

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人血清是一种复杂的体液成分,是组成人体赖以生存血液的重要生化物质基础。其蛋白质组成种类繁多,但高、低丰度蛋白质差异极大,如何简单高效的将人血清中高、低丰度蛋白质进行分离,探究那些信号传导与调控的低丰度关键蛋白质,仍是蛋白质组学发展的难题。本文采用待定模板分子印迹冰胶法,制备出以人血清蛋白质为模板的疏松大孔,传质能力强,且机械性能及稳定性良好的印迹冰胶材料。并将此材料应用于人血清中,探究其对人血清高、丰度蛋白质的特异性识别与分离性能。基于此,本文的研究内容主要分为以下三个部分的:  1.聚丙烯酰胺冰胶材料的制备与表征  以丙烯酰胺为单体,N,N-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂,丙烯酸和二烯丙基胺为功能单体,过硫酸铵与亚硫酸氢钠为引发剂,通过冰冻聚合法制备冰胶材料。探究聚合过程中反应溶剂、单体与交联剂比例、丙烯酸与二烯丙基胺比例、引发剂的选择等一系列反应条件对于冰胶材料形成的影响。利用数码照片,红外光谱,扫描电镜和热重分析对其进行表征。实验表明,在浓度为10mM,pH=7.40的磷酸缓冲液中以质量比为5∶3的丙烯酰胺与N,N-亚甲基双丙烯酰胺为单体与交联剂,体积比为2∶1丙烯酸和二烯丙基胺为功能单体,0.10g过硫酸铵与0.05g亚硫酸氢钠为引发剂;在-20℃的条件下反应至少24小时(h),可得到疏松大孔,弹性极佳并能重复利用的高吸附量冰胶材料。  2.印迹冰胶材料对蛋白质样品的处理  利用待定模板分子印迹冰胶法制备以实际复杂样品人血清为模板的印迹冰胶材料,对其洗脱剂、吸附、分离性能以及对模板分子的选择性进行探究,将其作为固定相应用在高效液相色谱中。当人血清与预聚合液的体积比为1∶2,1mol/L NaCl与10g/L SDS的混合溶液为洗脱剂时,所制备的印迹冰胶材料能够对印迹模板分子人血清蛋白质进行高效的分离,其吸附量为33.20mg/g,表观吸附因子为6.62,而对牛血清蛋白质及硫脲的值分别为8.82mg/g,4.52mg/g;1.96,1.06;将其作为色谱固定相应用于高效液相色谱时,对人血清有5.33分钟(min)的保留时间,牛血清、硫脲的保留时间分别为0.66min、0.49min。  3.人血清蛋白质印迹冰胶材料与组学研究  利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪和蛋白质组学无标记定量分析法对人血清原样,经人血清蛋白质印迹冰胶材料、非印迹冰胶材料处理后的人血清滤液进一系列蛋白质组学的处理、分析和鉴定。实验表明,人血清印迹冰胶材料能将人血清白蛋白等高丰度蛋白质去除,同时使血红素结合蛋白、丛生蛋白、α-1-酸性糖蛋白以及载脂蛋白等的含量也减少至人血清原样中的十分之一,甚至更少。因此,可利用此材料对人血清中那些以低丰度存在的信号传导和调控的关键蛋白质进行探究,这对未来蛋白质组学技术的发展有着不可低估的促进意义。
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