水稻DNA高通量提取与加速繁育技术的研究应用

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水稻是中国最重要的经济粮食作物,其品种选育的进步直接关系我国的粮食安全。常规育种技术与分子标记技术的结合为水稻新品种选育提供了有力支撑,加速了水稻选育进程。但是,水稻是典型的短光喜温作物,在我国的大部分区域一年只能栽培1-2个世代,而培育一个水稻新品种通常需8-10个世代约5-6年的时间,这无疑限制了水稻新品种选育的效率。对于分子标记而言,大量DNA的快速高效提取是提高分子标记应用效率的关键环节,然而目前普遍采用的方法是剪取植物的叶片并提取DNA,该方法成本高、效率低并且容易出现单株与DNA样本无法对应的错误。因此,研究适合水稻的加速繁育方案和高通量DNA提取技术,对于提升水稻新品种选育效率具有重要应用价值。针对上述问题,本研究提出以96孔板批量捕获水稻根部组织并高效提取DNA,以克服传统DNA提取方法的局限性;此外,本研究还以籼稻华航39与粳稻日本晴为材料,研究了在全程液体培养条件下不同密度及不同时间光照处理对水稻生长发育的影响,寻找适合水稻的加速繁育技术流程。主要研究结果如下:1、本研究开发了适用于水稻种子生长及根部组织批量提取的“双层生长板”装置,实现水稻从播种到根部组织样品的获取全部在96孔板中进行。与传统剪取叶片法比较,本方法获取96个样本组织仅耗时约10 min,而剪取叶片法耗时约30 min;此外,本方法获取的样本组织与来源个体精确对应,不需要额外的样本标记,成功率为100%。2、本研究开发了改良TRIS-EDTA法提取水稻根部组织,并分析了该方法提取DNA的效率。与CTAB法、磁珠法比较,改良TRIS-EDTA法提取的DNA个体间差异较小,浓度平均值为92.54 ng/ul;DNA A260/280平均值为1.74,DNA纯度较高;所需时间仅为传统CTAB方法的1/20。利用GS3基因引物扩增该方法提取DNA,扩增产物均条带明亮、清晰,片段大小符合预期,稳定性高,能满足分子标记分析需求。3、本研究开发了适合水稻的全生育期液体培养方法,提高了水稻种植的效率。本研究提出了改良的水稻营养液,以Ca(NO3)2·NH4NO3·10H2O代替NH4NO3提供N源;利用泡沫板实现幼苗的定位及悬浮于液体培养基上,为根的发育提供充足空间。进一步比较了种植密度对于农艺性状的影响,发现结实率、千粒重与种植密度相关性不高,种植密度为1-2株/cm~2是全程液体培养较为合适的密度。4、在全生育期液体培养条件下,本研究发现不同光照时间对于水稻生育期及农艺性状具有重要影响。利用16h光照+8h黑暗处理10d,然后转入10h光照+14h黑暗条件,其全生育期可以缩短10%,并且对农艺性状无不利影响,籼稻和粳稻趋势一致。本试验提出的控制水稻生长发育的方法可实现从移栽到收获每年繁育接近4个世代,与自然条件下育种历程(2个世代/年)相比,可提升效率50%左右,显著加速水稻育种进程。综上所述,本研究开发的水稻根部组织DNA获取方法克服了传统DNA样本获取工作量大、费时费力的缺点,可有效服务于水稻分子育种和突变体基因型筛选;提出的全生育期营养液培养和光照控制可以提高水稻种植效率,缩短水稻生育期,加速水稻遗传进程。研究结果对于提升水稻新品种选育效率具有重要的实践价值。
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