产甲基丙二酰辅酶A的假单孢菌菌株和德胺糖表达载体的构建

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聚酮化合物是一大类结构多样性的天然产物,并广泛应用于治疗学,很多聚酮化合物需要以甲基丙二酰辅酶A(mm-CoA)作为整合C3单元的延伸单位。mm-CoA可以通过两条途径合成:PCC(丙酰基CoA羧化酶)途径,该途径由两个基因:accA1和pccB组成,accA1基因编码丙酰基辅酶A羧化酶的α亚单元,pccB基因编码羧基转移酶亚单元;MCM途径,MCM基因簇由三个开放阅读框组成,即mm-CoA变位酶(MCM基因)、差向异构酶(epi基因)和ArgK共同完成。 用PCR的方法克隆MCM基因簇,从Escherichia coli(大肠杆菌)中扩增mm-CoA变位酶基因和ArgK基因,从Streptomyces coelicolor A3(2)(天蓝色链霉菌)中扩增差向异构酶基因;同时从Pseudomonas putida KT2440(恶臭假单胞菌)中扩增两段同源区域:left基因和right基因(1eft基因位于gph基因左侧,包含rpe基因,长度为1kb;right基因位于gph基因右侧,是trpE基因的一部分,长度为1.0kb);以pACYC177为模板扩增卡那霉素抗性基因(Kan抗性基因),长度为1.0kb,以上六个基因,颓序为:left-kan-epi-mcm-argK-right,这样MCM基因簇处于Kan抗性基因启动子的驱动,将所构建的基因盒克隆到P.putida KT2440转化载体pEX100TLinK。该载体含有蔗糖敏感型负筛选标记SacB基因,当含有MCM基因簇的质粒通过结合转移的方法异源表达到P.putida KT2440,同源区域两端发生双交换,MCM基因簇被整合到P. putida KT2440基因组DNA,同时也有发生单交换的情况,单交换的菌株pEX100TLinK也被整合到P.putida KT2440基因组DNA中,由于SacB基因的存在,单交换的菌株不能在含有蔗糖的培养基中生长,因此,结合转移后转化子经蔗糖筛选后长出的多数是双交换的菌株。 PCC基因簇由两个基因组成:accA1和pecB。aeeA1基因和pecB基因都来源于S.coelicolor。用同样的方法克隆抗性基因和同源区域,共五个基因,顺序为:left-kan-aeeA1-pceB-right,克隆到p. putida KT2440中转化载体pEX100TLinK,同样方法筛选转化子并验证。 MCM基因簇和PCC基因簇异源表达到P.putida KT2440中。对于已知基因簇异源表达可以选择E.coil,S.lividans、P.putida、B.subtilis,很明显每个系统都有其局限性,因此高效的表达一般都发生在与基因簇相近的微生物。放线菌及相关的链霉菌是被应用最广泛的异源表达体系,因为它们能提供聚酮化合物生物合成全部的装置,而且多数已知的次级代谢产物生物合成基因簇都源自该属。大肠杆菌也是颇受欢迎的异源表达体系,因为它是目前遗传学上的工具、有成熟的发酵方面知识、易于操作,但是它也有很多缺点,如与多数生物合成基因簇比有不同的G+C含量。在放线菌和E.coli间的差距可以由P.putida来弥补,P.putida产生的PKS/NRPS杂环分子是天然产生的五倍,发酵时间却缩短了三倍。P.putida拥有E.coli的优势,如易于操作、遗传学工其、可比的生长率;也有放线菌的特性,像高的G+C含量、能产生次级代谢产物。 MCM基因簇和PCC基因簇异源表达的重组菌株通过GC/MC的方法进行分析。甲基丙二酸盐及其CoA酯和丁醇反应后生成甲基丙二酸的二丁基酯(mmdiBE),mmdiBE通过GC/MS定量分析。   格尔德霉素(Geldanamyein,GA)是一种苯醌安莎类抗生素,它和ATP竞争结合热休克蛋白Hsp90的ATP结合位点,影响Hsp90的功能。从药效角度来看,在几种入类癌症中,Hsp90介导的蛋自在信号转导和转录中有重要作用,这种治疗靶点还没有被运用。因此引起人们研究GA的极大地兴趣,并将GA及其类似物列为潜在的抗癌药物。但其具有较强的肝毒性,而且水溶性也不好,在有机溶剂溶解状态下稳定性差,且见光易分解,对热、酸、碱均不稳定,所以需要对其结构进行相应改造,寻找毒性和活性更好的衍生物。 对GA的结构改造主要通过生物学方法和化学方法,通过生物学方法改造化合物的结构,尤其特殊的优势;首先,通过生物学方法可以实现化学反应难以进行的反应;其次,可以实现对化合物多位点的改造,产生多种衍生物;最后,生物学方法获得基因工程菌进行发酵、提取的生产工艺简便,对环境的污染少。本文想以生物学方法对GA结构进行改造,通过引入糖(德胺糖)组分,将糖的基因和大环内酯类化含物的表达相偶联,以期改造格尔德霉素的溶解性。  德胺糖是一种重要的脱氧胺基糖,很多结构相关的大环内酯类化合物都含有德胺糖,如红霉素,苦霉素、酒霉素。本研究选用的德胺糖生物合成基因来源予S.venezuelae的des基因簇,其12kb的生物含成基因蔟是由六个结构基因、一个调节基因和一个外排基因组成,即desⅧ-Ⅶ-Ⅵ-R-V-Ⅳ-Ⅲ-Ⅱ-Ⅰ,可分为desⅧ-Ⅶ-Ⅵ-R和desV-Ⅳ-Ⅲ-Ⅱ-Ⅰ两个转录单元。实验证明德胺糖可与数种非天然糖苷结合两形成多种有活性的化合物,在底物的选择上有着较大的宽容性,因此将之在不同的微生物(尤其是在产生诸多类型的次级代谢产物的放线菌)中进行表达,有可能创制新的、活性更佳的衍生物,为药物研发打下基础。
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